高效液相色譜法檢測(cè)菜豆中阿維菌素殘留量

張儒令 安鳳穎 胡德禹 張鈺萍 張侃侃 盧平

摘要? ? 本文建立了反相高效液相色譜法測(cè)定菜豆中阿維菌素殘留量的方法，即以乙酸乙酯為提取劑，液液萃取凈化，經(jīng)N-甲基咪唑和三氟醋酸酐衍生化，采用高效液相色譜法-熒光檢測(cè)器（激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm）進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，為了確定1%阿維菌素水乳劑在菜豆中的施用安全性，通過(guò)2年兩地田間試驗(yàn)和樣品室內(nèi)檢測(cè)試驗(yàn)，研究了其在菜豆上的消解動(dòng)態(tài)及最終殘留量。結(jié)果表明，在0.050～5.000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，阿維菌素的濃度與峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)γ=0.999 3。添加濃度在0.004 4～0.440 0 mg/kg時(shí)，方法的平均回收率為94.35%～99.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.81%～5.84%;以1%阿維菌素水乳劑0.45 g/m2噴藥，阿維菌素在菜豆上的消解半衰期為1.4～1.7 d;施藥7 d后采集的菜豆樣品中阿維菌素含量均低于MRL值0.05 mg/kg。本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于阿維菌素在菜豆上的殘留量測(cè)定。

關(guān)鍵詞? ? 阿維菌素;菜豆;殘留;消解動(dòng)態(tài);高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)? ? S481+.8? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）06-0106-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Determination? of? Abamectin? Residue? in? Kidney? Bean? by? HPLC

ZHANG Ru-ling 1? ? AN Feng-ying 1? ? HU De-yu 2 *? ? ZHANG Yu-ping 2? ? ZHANG Kan-kan 2? ? LU Ping 2

（1 Tongren Vocational and Technical College，Tongren Guizhou 554300; 2 Research and Development Cnter for Fine Chemicals，Guizhou University）

Abstract? ? A reversed-phase HPLC method for the determination of avermectin residues in kidney bean was established.The avermectin residues in kidney bean were extracted and purified by liquid-liquid extraction with ethyl acetate as the extractant.After derivatization with N-methylimidazole and trifluoroacetic anhydride，the avermectin residues in kidney bean were determined by HPLC with fluorescence detector（excitation wavelength was 365 nm and emission wavelength was 470 nm）.At the same time，the digestion dynamics and the final residue of abamectin water emulsion in kidney bean were studied through two years of two fields test and sample laboratory test，in order to determine the application safety of 1% abamectin water emulsion in kidney bean.The results showed that in the range of 0.050-5.000 μg/mL，the linear relationship between avermectin concentration and peak area was good，and the linear correlation coefficient was 0.999 3.When the concentration was 0.004 4-0.440 0 mg/kg，the average recovery of the method was 94.35%-99.42%，and the relative standard deviation was 4.81%-5.84%.When the 1% abamectin water emulsion was 0.45 g/m2，the half-life of abamectin digestion on kidney bean was 1.4-1.7 d.The content of abamectin in kidney bean samples collected after 7 days was lower than that of MRL 0.05 mg/kg.This method is simple，rapid and accurate.It is suitable for the determination of avermectin residue in kidney bean.

Key words? ? abamectin;kidney bean;residue;digestion dynamic;HPLC

阿維菌素是一類(lèi)具有殺蟲(chóng)、殺螨、殺線蟲(chóng)活性的十六元環(huán)內(nèi)酯雙糖類(lèi)化合物，是經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵、提取的新型抗生素類(lèi)殺蟲(chóng)殺螨劑[1-7]，對(duì)多種作物的害蟲(chóng)和螨類(lèi)具有觸殺和胃毒作用，同時(shí)具有微弱的熏蒸作用，無(wú)內(nèi)吸作用[8-10]，具有廣譜、高效、低殘留等特點(diǎn)，不易對(duì)土壤各種微生物和各種酶產(chǎn)生較大危害[11]，是當(dāng)前農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)綜合防治中理想的生物農(nóng)藥[12]。

關(guān)于阿維菌素的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外有大量報(bào)道，張少華等[13]建立了以乙腈為提取溶劑，測(cè)定蔥中阿維菌素殘留。趙領(lǐng)軍等[14]通過(guò)乙腈勻質(zhì)提取測(cè)定冬棗中阿維菌素殘留量。張紅艷等[15]采用了甲醇振蕩提取，二氯甲烷萃取凈化，測(cè)定黃瓜和梨中阿維菌素殘留。王曉菁等[16]采用酸性乙腈溶液提取，建立了高效液相色譜法分析枸杞中阿維菌素殘留量的方法。劉金鳳等[17]采用樣品中加入鹽酸溶液、丙酮，振蕩提取，測(cè)定土壤中阿維菌素殘留量。

阿維菌素可用于防治菜豆上的美洲斑潛蠅，但其在菜豆上的殘留檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道。本文結(jié)合文獻(xiàn)中阿維菌素提取、檢測(cè)方法，在建立菜豆中阿維菌素殘留分析方法的基礎(chǔ)上，研究了1%阿維菌素水乳劑在菜豆中的消解動(dòng)態(tài)，得到此農(nóng)藥在菜豆上的消解半衰期，為其在菜豆上的合理施用提供參考依據(jù)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 儀器與試劑

高效液相色譜：Agilent 1100;艾柯超純水機(jī)：AKJY-10（臺(tái)灣艾柯，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BU

CHI R-210（瑞士BUCHI公司）。

阿維菌素標(biāo)樣（純度≥99.4%，北京北化恒信生物技術(shù)有限公司）;甲醇（色譜純）;乙酸乙酯（分析純）;無(wú)水乙醇（分析純）;飽和氯化鈉水溶液;超純水;無(wú)水硫酸鈉（分析純，550 ℃烘烤5 h，于干燥器中保存?zhèn)溆茫?硅藻土（Celite 545）;乙腈（分析純）;三氟醋酸酐（分析純）;N-甲基咪唑（分析純）。

試驗(yàn)藥劑：1%阿維菌素水乳劑;試驗(yàn)作物：菜豆，品種為雙豐二號(hào)）。

1.2? ? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)農(nóng)藥殘留登記田間試驗(yàn)要求，進(jìn)行了1%阿維菌素水乳劑在菜豆上2年兩地（貴州省貴陽(yáng)市、北京市）田間試驗(yàn)，試驗(yàn)嚴(yán)格按照《田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》中的相關(guān)需求執(zhí)行。

1.2.1? ? 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)和1個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)小區(qū)面積為30 m2左右，于菜豆生長(zhǎng)至成熟個(gè)體一半大小時(shí)，以1%阿維菌素水乳劑按照推薦高劑量的1.5倍（0.450 g/m2）對(duì)菜豆植株噴霧施藥1次后，按間隔2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d取樣，采用五點(diǎn)取樣法，每小區(qū)取菜豆2 kg，切碎，混勻，用四分法分取200～300 g，樣品裝于封口容器內(nèi)，-20 ℃保存于冷庫(kù)中，備用。

1.2.2? ? 最終殘留試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.2.1，以0.225、0.338 g/m2 2個(gè)劑量分別設(shè)3次、4次噴藥，施藥間隔期7 d。距最后一次施藥后1、3、5、7 d各取樣1次，取樣及樣品處理方法同消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。

1.3? ? 分析方法

1.3.1? ? 提取凈化。準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g菜豆，置于250 mL具塞三角瓶中，加入60 mL乙酸乙酯、25 mL二次水，混勻振蕩提取1 h，靜置10 min，在鋪有Celite 545的砂芯漏斗中抽濾，濾渣再加入60 mL乙酸乙酯振蕩提取1 h，抽濾，抽濾后用10 mL乙酸乙酯洗滌容器和殘?jiān)?，合并濾液，然后轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，向其中加入20 mL飽和食鹽水，萃取凈化，收集上層有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥后收集至150 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（50 ℃）近干，待衍生化。

1.3.2? ? 衍生化方法。將1.3.1中待衍生化樣品，氮?dú)饬鞔蹈桑? mL乙腈定容，向其中加入N-甲基咪唑和三氟醋酸酐各0.3 mL，黑暗處衍生化反應(yīng)30 min，向其中加入1 mL無(wú)水甲醇，終止衍生化反應(yīng)，黑暗處?kù)o止30 min，經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3? ? 色譜分析條件。檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，Ex=365 nm，Em=470 nm;色譜柱：S-Gel C18，5 μm（150×4.6 mm）流動(dòng)相為甲醇-水（95∶5，V∶V），流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量10.0 μL。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1? ? 檢測(cè)器的選擇。阿維菌素的高效液相色譜分析方法中常采用紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器。本試驗(yàn)分別采用這2種檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液在2種檢測(cè)器檢測(cè)出來(lái)的標(biāo)樣譜圖對(duì)稱(chēng)性均好，基線也平穩(wěn)，但紫外檢測(cè)器上雜質(zhì)峰稍多，在熒光檢測(cè)器上阿維菌素響應(yīng)值大，故本試驗(yàn)采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.2? ? 柱溫的選擇。柱溫對(duì)固定相、流動(dòng)相及待測(cè)組分在二者之間的分配都有重要的影響。本試驗(yàn)中，柱溫在20～40 ℃時(shí)對(duì)分離度的影響不大，故選擇25 ℃（柱溫箱控制）。

2.1.3? ? 流動(dòng)相的選擇。根據(jù)阿維菌素理化性質(zhì)及所查閱的國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，分別采用甲醇-水（98∶2，V∶V）、甲醇-水（96∶4，V∶V）、甲醇-水（95∶5，V/V）作為流動(dòng)相，最終選擇甲醇-水（95∶5，V/V）為流動(dòng)相，此流動(dòng)相比例下的色譜圖峰寬適中、峰型對(duì)稱(chēng)、分離度好。

2.2? ? 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

根據(jù)相似相容原理，綜合文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)先后加入丙酮、甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯和二次水對(duì)菜豆中的阿維菌素進(jìn)行提取。其中，用丙酮和甲醇振蕩提取后，直接測(cè)定，回收率較低;而采用無(wú)水乙醇提取后用二氯甲烷萃取，以及先后加入乙酸乙酯、水進(jìn)行振蕩提取，二者的回收率均達(dá)到70%以上，考慮到前者使用的萃取劑二氯甲烷毒性較大且不夠經(jīng)濟(jì)，故本試驗(yàn)選擇后者作為提取劑。

2.3? ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

配制0.050、0.176、0.500、1.760、5.000 μg/mL質(zhì)量濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液按本文1.3.2中所述方法衍生化后進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）做線性回歸（圖1），得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=68.582C-3.400 4，相關(guān)系數(shù)γ=0.999 3。阿維菌素在0.050～5.000 μg/mL的濃度范圍與面積線性關(guān)系良好，能較好地達(dá)到外標(biāo)法定量分析的目的。

2.4? ? 方法的準(zhǔn)確度及精密度

從表1、圖2、圖3、圖4可以看出，菜豆添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004 4～0.440 0 mg/kg的阿維菌素時(shí)，方法的平均回收率為94.35%～99.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.81%～5.84%。方法的精密度和準(zhǔn)確度較好，均符合農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求。

2.5? ? 方法的靈敏度

在本文1.3.3已選擇高效液相色譜條件下，阿維菌素的最小檢出量為8.7×10-11 g;通過(guò)添加回收率試驗(yàn)，測(cè)得菜豆中阿維菌素的最低檢出濃度為0.004 4 mg/kg。

2.6? ? 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果

按上述試驗(yàn)方法對(duì)所采集的菜豆樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到 1%阿維菌素水乳劑在貴州省貴陽(yáng)市、北京市菜豆中的消解動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，具體見(jiàn)表2、圖5、圖 6。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到2009年、2010年貴陽(yáng)市和北京市菜豆樣品中阿維菌素消解動(dòng)態(tài)方程，即C=0.452 2exp（-0.415 1 t）（貴陽(yáng)市2009年）、C=0.515 6exp（-0.504 4 t）（貴陽(yáng)市2010年）、C=0.361 6exp（-0.412 2 t）（北京市2009年）、C=0.474 8exp（-0.505 6 t）（北京市2010年），半衰期分別為1.7、1.4、1.7、1.4 d，相關(guān)系數(shù)（γ）分別為-0.917 1、-0.949 9、-0.931 3、-0.951 2。

3? ? 結(jié)論

本文首次建立了菜豆中阿維菌素檢測(cè)方法。采用乙酸乙酯、二次水對(duì)菜豆中阿維菌素進(jìn)行振蕩提取、液-液萃取凈化的前處理方法毒性小、費(fèi)用低，且阿維菌素色譜峰面積與質(zhì)量濃度之間有較好的線性關(guān)系，方法的準(zhǔn)確度、精密度等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788—2004）中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的基本要求，可有效適用于菜豆中阿維菌素殘留的定量分析。以1%阿維菌素水乳劑0.450 g/m2推薦劑量施用，200倍稀釋液均勻噴施，阿維菌素在供試兩地的菜豆中消解半衰期為1.4～1.7 d，施藥前3 d，阿維菌素降解速度很快，施藥10、14 d后，菜豆中阿維菌素的殘留量低于最低檢出濃度0.004 4 mg/kg，小于推薦MRL值0.05 mg/kg[18]。

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