上海市售鱖漁藥殘留現(xiàn)狀的調(diào)查研究

吳紅巖，趙金良，郝月月，朱書琴，周云紅

(上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

近些年，因漁藥違規(guī)超標(biāo)使用引發(fā)的食品安全問(wèn)題，已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。2006-2018年，全國(guó)共發(fā)生水產(chǎn)品質(zhì)量安全事件172起，其中包括2006年上海多寶魚(Scophthalmusmaximus)事件、2007年山東多寶魚事件、2013年青島甲醛泡小銀魚(Cephalophyllumloreum)等事件[1]。水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的漁用藥物可分為禁用漁藥、限量漁藥和未監(jiān)管漁藥三類。2002年，孔雀石綠(malachite green,MG)和硝基呋喃類(nitrofurans,NFs)已被列入《食用動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》，標(biāo)明在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中禁止添加以及在水產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中不得檢出?？兹甘G是一種有毒的三苯甲烷類人工合成有機(jī)化合物，可做染料，也可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖殺菌，很容易在魚類體內(nèi)累積[2]。在養(yǎng)殖環(huán)境中，孔雀石綠極易轉(zhuǎn)化為無(wú)色孔雀石綠，并難以消解。在孔雀石綠濃度為1 mg/L的池塘水體中，即使經(jīng)過(guò)360 d的養(yǎng)殖活動(dòng)，仍能在池塘底泥中檢測(cè)到無(wú)色孔雀石綠的殘留[3]。硝基呋喃類藥物主要用于水環(huán)境消毒，或拌餌投喂以防治細(xì)菌性疾病，尤其對(duì)腸球菌屬等革蘭氏陽(yáng)性菌引起的感染、皮膚和粘膜損傷后的細(xì)菌感染具有良好的治療效果[4]。硝基呋喃類藥物及其代謝物在魚體內(nèi)的代謝消除規(guī)律受養(yǎng)殖種類、給藥量及給藥次數(shù)等的影響，如青石斑魚(Epinephelusawoara)連續(xù)7 d投喂100 mg/kg硝基呋喃類藥物飼料，在停藥后163 d后仍可檢測(cè)到代謝物的存在[5]；斑點(diǎn)叉尾鮰(IetalurusPunetaus)連續(xù)7 d，每天2次投喂10 mg/kg的餌料，其代謝物AOZ在各組織中的消除至少需要90 d[6]；用呋喃西林2 mg/L藥浴雜交鱧(斑鱧Channamaculata♀×烏鱧Channaargus♂)2 d，其代謝物產(chǎn)物SEM需要60 d才能低于0.25 μg/kg的檢測(cè)限[7]。喹諾酮類(4-quinolones,4-Qs)藥物，主要作為厭氧菌、革蘭氏陰性菌的抗菌藥。一般是溶解后全池潑灑，或是拌料投喂[8]。但喹諾酮類藥物屬抗生素，可能會(huì)促使部分水生細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[9]，耐藥菌和有喹諾酮類殘留的水產(chǎn)品都有可能對(duì)消費(fèi)者健康產(chǎn)生不利影響[10]。為此，農(nóng)業(yè)部公告第2292號(hào)規(guī)定，諾氟沙星為禁用藥物，GB31650-2019規(guī)定[11]，恩諾沙星、環(huán)丙沙星屬殘留限量藥物，二者檢出量相加不得超過(guò)0.1 mg/kg。亞甲基藍(lán)(methylene blue,MB)是染料的一種，淡水養(yǎng)殖中可用于防治水霉病、紅嘴病和小瓜蟲病等。已有研究表明，10 mg/L亞甲基藍(lán)藥浴日本鰻鱺(Anguillajaponica)0.5 h，64 d后仍能檢測(cè)到亞甲基藍(lán)及其代謝物[12]，且亞甲基藍(lán)對(duì)魚卵胚胎的發(fā)育有一定的毒性作用[13]。目前美國(guó)食品監(jiān)督管理局(FDA)已禁止亞甲基藍(lán)用于食用魚的養(yǎng)殖，日本《肯定列表》也規(guī)定其在水產(chǎn)品中最高限量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg，但中國(guó)目前對(duì)亞甲基藍(lán)在動(dòng)物源性食品中的限量還沒(méi)有相關(guān)規(guī)定[14]。

鱖(Sinipercachuatsi)是我國(guó)傳統(tǒng)名貴淡水經(jīng)濟(jì)魚類。在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，鱖很容易受到多種病原生物(原生動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和病毒)的侵襲，難以擺脫漁用藥物的依賴。由于用藥不當(dāng)，漁藥殘留問(wèn)題比較突出，如2013年福建省養(yǎng)殖鱖孔雀石綠75.8 %的檢出率[15]、2015年廣東省鱖孔雀石綠19.1 μg/kg的檢出量[16]、以及2017農(nóng)業(yè)部全國(guó)抽檢鮮活水產(chǎn)品(鱖)孔雀石綠及其代謝物14.8 %的檢出率。因此，鱖被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入《2017年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全專項(xiàng)整治方案》，“三魚兩藥”專項(xiàng)整治對(duì)象之一。隨著專項(xiàng)整治工作的落實(shí)與推進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)選取上海地區(qū)為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)水產(chǎn)品市場(chǎng)中鱖的全年抽樣，檢測(cè)養(yǎng)殖中常見(jiàn)漁藥(MG,NFs,4-Qs,MB)的殘留情況，了解鱖養(yǎng)殖中的用藥現(xiàn)狀，以期為鱖水產(chǎn)品的質(zhì)量安全管理工作提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀(安捷倫1100型配紫外熒光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司)；N-1300D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)；MDF-U53V型超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；5417R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sartorius公司)；YP202N型電子精密天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DL-360A型超聲提取儀(上海之信儀器有限公司)；DS高速勻漿機(jī)(佛山市翁開(kāi)爾貿(mào)易有限公司)；Vortex-2漩渦震蕩儀(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)；HSE-12D固相萃取裝置(重慶中普科技有限公司)。

1.1.2 試劑

孔雀石綠(CAS:569-64-2)及無(wú)色孔雀石綠(CAS:129-73-7)標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度>98%)；呋喃唑酮(furazolidone,CAS:67-45-8)、呋喃妥因(furadantin,CAS:67-20-9)、呋喃西林(nitrofurazone,CAS:59-87-0)、呋喃它酮(furaltadone,CAS:139-91-3)，對(duì)應(yīng)代謝物：3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)、1-氨基-2-乙內(nèi)酰(AHD)、氨基脲(SEM)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)的標(biāo)準(zhǔn)品，(美國(guó)Sigma公司，純度≥99 %)；環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CAS:85721-33-1)、恩諾沙星(enrofloxacin,CAS:93106-60-6)、諾氟沙星(norfloxacin,CAS:70458-96-7)標(biāo)準(zhǔn)品(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，純度≥99.5 %)；亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司，純度≥99.5 %)。

冰乙酸、無(wú)水硫酸鈉、乙酸乙酯、鄰氯苯甲醛、庚烷磺酸鈉、甲醇為色譜純，正己烷、乙酸銨、二甘醇、四丁基溴化銨、磷酸二氫鈉、對(duì)甲苯磺酸、鹽酸羥胺為分析純，以及中性氧化鋁(100-200目)、酸性氧化鋁(80-120目)、氫氧化鈉、超純水(≥18 MΩ·cm@25 ℃)、0.22 μm微孔濾膜、0.45 μm微孔濾膜，均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；三氯乙酸為優(yōu)級(jí)純，異辛烷、乙腈、二氯甲烷、檸檬酸為色譜純，以及硅膠C18鍵合材料(100～200目)、吸附性離子交換樹脂(100～200目)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；陽(yáng)離子交換萃取柱(100 mg/3 mL)、酸性氧化鋁柱(1 g/3 mL)、中性氧化鋁柱(1 g/3 mL)購(gòu)自武漢敬信科技有限公司；C18-CN凈化柱(200mg/3mL)購(gòu)自武漢市偉琪博星生物科技有限公司。

1.2 樣本采集與前處理

1.2.1 樣品采集

從2018年4月-2019年3月，每月下旬到上海市某水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買500 g左右的鱖6尾，密封袋打包充氧，活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。去皮后取背部肌肉，并分割成小塊，用絞肉機(jī)低溫絞碎均質(zhì)，分類封裝，置-80 ℃保存待測(cè)。

1.2.2 前處理及測(cè)定

孔雀石綠及無(wú)色孔雀石綠樣品的前處理及測(cè)定均參照GB/T 19857-2005高效液相色譜法[17]；硝基呋喃類藥物樣品的前處理及測(cè)定均參照GB/T 1007-2008高效液相色譜法[18]；喹諾酮類藥物樣品的前處理及測(cè)定均參照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告[19]；亞甲基藍(lán)樣品的前處理及測(cè)定均參照SN/T 1974-2007高效液相色譜法[20]；

1.2.3 色譜條件

取適量標(biāo)準(zhǔn)品，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依濃度梯度分別檢測(cè)獲取保留時(shí)間和出峰面積，作定量用。具體檢測(cè)的色譜條件參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)藥物及其代謝產(chǎn)物的色譜條件Tab.1 Chromatographic conditions for detecting drugs and metabolites

注：MG/LMG表示孔雀石綠/隱色孔雀石綠，NFs表示硝基呋喃類，4-Qs表示喹諾酮類，MB表示亞甲基藍(lán)。

1.2.4 質(zhì)量控制

處理前，清洗均質(zhì)器等前處理設(shè)備，防止污染。在對(duì)72份鱖樣分別進(jìn)行10種藥物檢測(cè)的同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照。當(dāng)出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)，需對(duì)該批次樣重新測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理均采用SPSS19.0軟件分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 孔雀石綠與無(wú)色孔雀石綠

全年共計(jì)檢測(cè)72尾鱖，孔雀石綠、無(wú)色孔雀石綠均無(wú)檢出樣(表2)。檢測(cè)鱖為市場(chǎng)采集，又因孔雀石綠、無(wú)色孔雀石綠的代謝周期較長(zhǎng)，說(shuō)明市售鱖在運(yùn)輸和暫養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有孔雀石綠添加，以及當(dāng)齡鱖違規(guī)使用孔雀石綠的可能性也不大。

2.2 硝基呋喃類藥物

全年共抽檢鱖樣品72份，檢出率為50 %(36/72)(表2)。呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)未檢出；呋喃西林代謝物(SEM)檢出8尾，檢出率11.1%，檢出平均濃度為(0.49±0.03)μg/kg；呋喃妥因代謝物(AHD)檢出32尾，檢出率44.4%，檢出平均濃度為(3.51±2.27)μg/kg。可以看出，部分秋冬季上市銷售的鱖體內(nèi)含有硝基呋喃類藥物代謝物，尤其是AHD的殘留量與檢出率均較高。說(shuō)明在鱖生產(chǎn)或流通中仍存在硝基呋喃違禁藥物使用現(xiàn)象。

2.3 喹諾酮類藥物

全年共抽檢鱖樣品72份，檢出率為76.39%(55/72)(表2)。其中，恩諾沙星檢出13尾，檢出率18.06%，檢出平均濃度為(27.95±4.17)μg/kg；環(huán)丙沙星檢出51尾，檢出率70.83%，檢出平均濃度為(20.98±6.85)μg/kg；諾氟沙星檢出7尾檢出率9.72%，檢出平均濃度為(25.52±10.36)μg/kg。從全年看，喹諾酮類藥物在4-9月份的檢出次數(shù)(45個(gè))明顯高于其他月份(26個(gè))，平均檢出濃度(26.74±5.11)μg/kg與其他月份相似(16.57±2.34)μg/kg。說(shuō)明喹諾酮類藥物中，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星可能有濫用或休藥期不足的風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 亞甲基藍(lán)

全年共抽檢鱖樣品72份，檢出率為15.3%(11/72)(表2)。檢出平均濃度(123.5±10.1)μg/kg，說(shuō)明存在亞甲基藍(lán)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的現(xiàn)象。因我國(guó)未限定亞甲基藍(lán)在魚類肌肉中的最高限量，故從亞甲基藍(lán)較高的檢出量推測(cè)，亞甲基藍(lán)在市售鱖的養(yǎng)殖、運(yùn)輸以及銷售暫養(yǎng)環(huán)節(jié)均有可能被添加使用。但亞甲基藍(lán)的添加為單環(huán)節(jié)或多環(huán)節(jié)，還有待進(jìn)一步探究。

3 討論

3.1 孔雀石綠檢測(cè)結(jié)果特征分析

孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于防治水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等，且易被魚體迅速吸收到體內(nèi)不同組織，并轉(zhuǎn)化為毒性大、易殘留的無(wú)色孔雀石綠[21]。有研究表明，鱖體內(nèi)孔雀石綠、無(wú)色孔雀石綠完全消除分別需要58 d、270 d[22]，幾乎涵蓋了鱖從受精卵孵化到成魚上市的全部時(shí)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，上海市全年市售鱖肌肉中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠均未被檢出，表明農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的“三魚兩藥”專項(xiàng)整治行動(dòng)，對(duì)解決鱖生產(chǎn)中孔雀石綠的違禁使用問(wèn)題，效果極其顯著。

表2 上海市售鱖漁藥2018年4月-2019年3月間檢出情況Tab.2 Detection of Mandarin fish fishery drugs on sold in Shanghai market from April 2018 to March 2019 μg/kg

3.2 硝基呋喃類、喹諾酮類與亞甲基藍(lán)藥物的檢出特征分析

硝基呋喃類原藥在動(dòng)物體內(nèi)吸收迅速、代謝快、穩(wěn)定時(shí)間短，停藥3 d就會(huì)低于檢測(cè)限，但其代謝物卻能夠與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合，長(zhǎng)時(shí)間殘留在動(dòng)物體內(nèi)[23]。本實(shí)驗(yàn)中，鱖肌肉中呋喃唑酮和呋喃它酮代謝物未有檢出，呋喃西林和呋喃妥因代謝物檢出率分別為11.1 %，44.4 %，說(shuō)明在鱖養(yǎng)殖生產(chǎn)中仍存在少量硝基呋喃類藥物的違禁使用現(xiàn)象。值得注意的是，本次檢出樣品集中在當(dāng)年10月份到下年4月份之間，該上市期的鱖包括一部分早繁鱖，養(yǎng)殖生產(chǎn)期經(jīng)歷了夏秋高溫季節(jié)，容易引起各種寄生蟲病以及細(xì)菌性疾病的爆發(fā)[24]，因而，在養(yǎng)殖用藥中可能存在主動(dòng)或被動(dòng)使用違禁藥品的現(xiàn)象。這種季節(jié)性出現(xiàn)違禁藥物的現(xiàn)象，能夠?yàn)槲磥?lái)的生產(chǎn)監(jiān)管提供重要線索和依據(jù)。

喹諾酮類藥物屬抗生素，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的殘留易被消費(fèi)者攝入，對(duì)人體產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)[25]。本研究檢測(cè)了鱖肌肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星以及諾氟沙星三種喹諾酮類藥物的含量，其檢出率分別為：18.06%、70.83%、9.72%，該結(jié)果與煙臺(tái)市市售魚類[26]、杭州市市售魚類[27]相比，處于較高水平。喹諾酮類藥物作為限量藥物，允許在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。但在實(shí)際使用中，其用藥量大小、用藥次數(shù)以及休藥期長(zhǎng)短均難以控制。結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星全年可檢出，恩諾沙星、諾氟沙星只在4-10月份之間檢出，同樣表現(xiàn)出季節(jié)性。一般4-10月份上市銷售的鱖多是上一年秋苗繁殖養(yǎng)殖而來(lái)，養(yǎng)殖生產(chǎn)期多為冬春季節(jié)，水溫較低，容易引起部分細(xì)菌的爆發(fā)[28,29]，為保持養(yǎng)殖成活率以獲取市場(chǎng)利潤(rùn)，鱖生產(chǎn)階段可能存在藥物濫用或休藥期不足現(xiàn)象。

亞甲基藍(lán)在淡水養(yǎng)殖上可用于防治水霉病、紅嘴病、小瓜蟲病等。已有研究表明，15 mg/kg亞甲基藍(lán)藥浴異育銀鯽0.5 h，64 d后仍可在肌肉中檢測(cè)到亞甲基藍(lán)及其代謝物[12]，但中國(guó)目前對(duì)亞甲基藍(lán)在動(dòng)物源性食品中的限量還沒(méi)有相關(guān)規(guī)定。本研究中，亞甲基藍(lán)檢出率15.3 %，分布在4～9月份，說(shuō)明鱖的生產(chǎn)流通過(guò)程中存在亞甲基藍(lán)的使用現(xiàn)象，應(yīng)引起注意。