不同野生群體與家系養(yǎng)殖翹嘴鱖遺傳多樣性分析

成為為，夏儒龍，王青云，曾可為，宋 文，危起偉，鄧國喬，程穎紅

(1.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430207)

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)隸屬鱸形目鱖亞科鱖屬，是我國鱖屬的7個種中個體最大、生長速度最快的種類，其肉質(zhì)細嫩，無肌間剌，且富含大量的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，具有很高的營養(yǎng)價值，素有“淡水石斑魚”的美稱，是我國特有的名優(yōu)淡水經(jīng)濟魚類，為我國重要的名優(yōu)魚類養(yǎng)殖對象。歷史上長江中下游淺水湖泊均與干流相連通，近年來卻因大量的水電建筑(堤、壩和閘等)的興建而相繼阻隔，導(dǎo)致生境異質(zhì)性下降[1]。近年來由于過度捕撈，河湖面積大減及工業(yè)毒污水的嚴(yán)重污染，鱖類資源受到了嚴(yán)重威脅，翹嘴鱖野生種質(zhì)資源銳減、種質(zhì)退化、生長和抗逆性能下降等問題變得越來越嚴(yán)重[2-5]，同時翹嘴鱖人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖翹嘴鱖的種質(zhì)退化明顯，抗病力下降，嚴(yán)重制約了翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

趙金良等[6]對長江水系洞庭湖、鄱陽湖、秋浦河和太湖4個鱖群體共42尾的mtDNA控制區(qū)核苷酸序列進行了測定，獲得了長度785 bp的同源序列，利用控制區(qū)核苷酸序列構(gòu)建的NJ分子樹中，各群體內(nèi)的個體均未單獨成群，而是互有交叉。由于遺傳分化低，初步認為洞庭湖、鄱陽湖、秋浦河和太湖鱖群體可能同屬一個種群-長江種群。吳旭等[7]2010年對長江中下游不同地理種群鱖遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究，以長江、通江湖泊(洞庭湖、鄱陽湖)、陸封型湖泊(牛山湖、漲度湖、湯遜湖、肖四海湖)不同水體鱖為研究材料，利用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記對其種群遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明：由期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量指數(shù)(PIC)檢測的遺傳多樣性由大到小的順序為：長江、通江湖泊群體>無放流陸封型湖泊群體>放流的陸封型湖泊群體，并且發(fā)現(xiàn)一些稀有等位基因位點在陸封型湖泊鱖群體中消失；根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖，鱖群體被分成三支，長江、通江湖泊聚類為一支，無放流陸封型湖泊與放流陸封型湖泊亦分為兩支，研究結(jié)果表明，江湖阻隔是造成定居性魚類鱖種群間遺傳分化的重要原因之一。吳旭等[8]對肖四海湖野生和人工放流鱖群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明野生群體遺傳多樣性明顯高于放流增殖鱖群體，野生鱖群體表現(xiàn)出更豐富的遺傳多樣性；遺傳變異主要存在于群體間，而不是群體內(nèi)部，這充分反映近交及瓶頸效應(yīng)會引起養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致群體間的遺傳分化。以上研究結(jié)果均表明鱖長江野生群體對比通江湖泊和養(yǎng)殖群體均存在較高的遺傳多樣性，江湖阻隔導(dǎo)致的基因交流的減少是造成鱖種群間遺傳分化的重要原因之一。

隨著建壩與調(diào)水等水利工程的建設(shè)以及圍墾與人工引種等人們生活活動等，長江流域天然漁業(yè)資源量連續(xù)呈現(xiàn)出衰退的特征，瀕危和滅絕的種類也逐漸增加[9]。另外，人為的江湖阻斷也給長江流域淡水魚類的繁衍產(chǎn)生了極大的影響。這些都為長江流域淡水魚類生物多樣性的維持與保護提出了極大的挑戰(zhàn)。長江水系和支流湖泊以及家系養(yǎng)殖翹嘴鱖是否進一步出現(xiàn)了明顯的遺傳分化和某些稀有等位基因的缺失？基于以上問題，本項目以分子生物學(xué)結(jié)合生態(tài)學(xué)的方式，利用分子標(biāo)記(SSR)研究我國長江水系、通江湖泊、人工養(yǎng)殖的翹嘴鱖群體遺傳結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)分析群體遺傳多樣性現(xiàn)狀，在此基礎(chǔ)上劃分管理單元，為鱖類魚類資源開發(fā)與管理提供指導(dǎo)性建議，對合理開發(fā)和有效的物種保護策略的制定具有重要實際意義。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采集長江石首江段野生翹嘴鱖(YZ)63尾，梁子湖島野生(LZH)翹嘴鱖63尾，洞庭湖沅江江段(DTH)野生翹嘴鱖10尾，無錫董氏水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖場翹嘴鱖(WX)12尾，武漢鱖魚健康養(yǎng)殖小區(qū)武漢市佳恒水產(chǎn)有限公司(WH)200尾，共計348尾鰭條樣本，無水乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴增及毛細管電泳檢測

DNA提取采用磁珠法提取基因組DNA(試劑盒天根DP341)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后稀釋到約100 ng/μL用于PCR擴增。測定鱖性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選7對高度多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記(未發(fā)表數(shù)據(jù))合成熒光引物(FAM和HEX)，在各自特定的退火溫度下進行PCR擴增，PCR擴增體系和反應(yīng)程序如下，PCR反應(yīng)體系為10 μL，2×Taq PCR Master Mix(含染料)5 μL(包含Taq DNA Polymerase，Mg2+，dNTPS，指示染料和反應(yīng)Buffer)，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 100 ng，ddH2O 3 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃→52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；最后72 ℃末端延伸20 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)自動測序儀ABI 3730 xl(Rox-500 standard)微衛(wèi)星分型并用軟件GENEMAPPER V.4.0[10]讀取等位基因大小。

1.3 分析方法

采用PopGene32[11]進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計算群體的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳相似系數(shù)(I)、群體間遺傳距離(Ds)。用Cervus[12]軟件計算多態(tài)信息含量(PIC)。MEGA7.0軟件被用來依據(jù)遺傳距離進行群體UPGMA聚類分析。采用Arlequin V3.5.1.3[13]軟件中的AMOVA方法分析群體的遺傳變異，計算遺傳分化系數(shù)Fst來評價群體間的遺傳差異，通過1000次重復(fù)抽樣來檢驗群體間FST顯著性，使用Nm=(1-Fst)/4Fst計算群體間的基因流。用Structure 2.3.4軟件[14-15]進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，參數(shù)“Length of Burnin Period”設(shè)置為200 000，“Number of MCMC Repsafter Burnin”設(shè)置為1 200 000，k為1至8，每個k值運行10次。經(jīng)網(wǎng)址http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest在線計算獲得最佳k值，并利用CLUMPP_Windows.1.1.2[16]和distruct1.1[17]作遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

7個微衛(wèi)星位點在5個群體348尾個體檢測中均表現(xiàn)為多態(tài)性(表1)。7個多態(tài)性微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)范圍為18～36，平均值為29.14；有效等位基因數(shù)范圍為6.660～10.629，平均值為8.909；觀測雜合度范圍為0.784～0.928，平均值為0.853；期望雜合度范圍為0.851～0.907，平均值為0.886；平均多態(tài)信息量范圍為0.841～0.899，平均值為0.875；Fst范圍為0.028～0.084，平均值為0.051；基因流范圍為2.731～8.788，平均值為5.421(位點特征值詳見表1)。

7對微衛(wèi)星引物在5個群體中共檢測到526個等位基因，其中平均等位基因數(shù)：長江野生群體>梁子湖群體>武漢養(yǎng)殖群體>洞庭湖群體>無錫養(yǎng)殖群體；平均有效等位基因數(shù)：長江野生群體>梁子湖群體>洞庭湖群體>武漢養(yǎng)殖群體>無錫養(yǎng)殖群體；平均觀測雜合度：梁子湖群體>無錫養(yǎng)殖群體>長江野生群體>洞庭湖群體>武漢養(yǎng)殖群體；平均期望雜合度：長江野生群體>梁子湖群體>洞庭湖群體>無錫養(yǎng)殖群體>武漢養(yǎng)殖群體；平均多態(tài)信息量：長江野生群體>梁子湖群體>洞庭湖群體>武漢養(yǎng)殖群體>無錫養(yǎng)殖群體(詳細值見表2)。

表1 7個多態(tài)微衛(wèi)星特征值Tab.1 Characteristic values of 7 polymorphic microsatellites

表2 5個群體在微衛(wèi)星位點的遺傳信息Tab.2 Genetic diversity of microsatellite loci in five populations

2.2 遺傳分化

通過PopGene 32得到5個群體間的Nei氏遺傳距離(Ds)和遺傳相似系數(shù)I(表3)。5個群體的遺傳距離為0.277～0.813，遺傳相似系數(shù)為 0.444～0.758；長江野生群體和無錫養(yǎng)殖群體間的遺傳距離最大(0.813)，遺傳相似系數(shù)最小(0.444)；無錫養(yǎng)殖群體和武漢養(yǎng)殖群體間的遺傳距離最小(0.277)，遺傳相似系數(shù)最大(0.758)。

表3 5個群體的Nei氏遺傳相似系數(shù)(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.3 Nei′s genetic similarity coefficient(upper triangle) and genetic distance(lower triangle)in 5 populations

根據(jù)Nei氏遺傳距離采用MEGA7.0軟件進行群體UPGMA聚類分析，結(jié)果顯示梁子湖群體和洞庭湖群體聚為一支，無錫養(yǎng)殖群體和武漢養(yǎng)殖群體聚為一支，繼而這四個群體共聚為一支，最后和長江野生群體聚為一大支(詳見圖1)。

利用Arlequin軟件計算每兩個群體之間的遺傳分化值，結(jié)果顯示：梁子湖群體和洞庭湖群體之間的遺傳分化系數(shù)最小，為0.013(P=0.865>0.05)，長江野生群體和武漢養(yǎng)殖群體之間的遺傳分化系數(shù)最大，為0.077(P=0.000<0.05)(表4)。

AMOVA分析表明：在總遺傳變異中，群體間的遺傳變異占5.95%，群體內(nèi)遺傳變異占 94.05%(表5)。說明5個群體中大部分的遺傳變異來自于群體內(nèi)。

圖1 基于Nei氏遺傳距離構(gòu)建5個地理群體的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA clustering map of 5 populations based on Nei′s genetic distance

表4 5個群體的遺傳分化指數(shù)(對角線下)和P值(對角線上)Tab.4 Genetic differentiation index(below diagonal)and P value(above diagonal)in 5 populations

表5 5個群體的 AMOVA分析Tab.5 AMOVA analysis of 5 populations

2.3 種群結(jié)構(gòu)

運用structure2.3.4軟件對5個群體進行遺傳結(jié)構(gòu)分析。在Deltak值與k值的關(guān)系變動圖中結(jié)果顯示在k=2時，Δk值最大(圖2)，說明這5個群體可分為2個亞群，分別為為亞群I和亞群II。其中亞群I大部分分布于梁子湖群體、洞庭湖群體和長江野生群體，亞群II大部分布于剩余的武漢養(yǎng)殖群體和無錫養(yǎng)殖群體中。

圖2 5個群體在k=2的遺傳結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Genetic structure of 5 populations in k=2

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性

多態(tài)性信息含量(PIC)是衡量基因多態(tài)性的指標(biāo)[18]。當(dāng)PIC>0.5時，該位點為高度多態(tài)位點；0.25

3.2 群體遺傳分化

基因流對于遺傳結(jié)構(gòu)的影響是，基因流越順暢，遺傳分化的程度將越低[19-20]。遺傳分化指數(shù)Fst若在0～0.05間為無分化，0.05～0.15間為中度分化，0.15～0.25間為高度分化[21]。本研究所顯示這幾大群體呈現(xiàn)一個中度分化的趨勢，并不是一個無分化的大種群，梁子湖群體和洞庭湖群體聚為一支，無錫養(yǎng)殖群體和武漢養(yǎng)殖群體聚為一支，繼而這四個群體共聚為一支，最后和長江野生群體聚為一大支，5個群體可分為2個亞群，其中亞群I包括梁子湖群體、洞庭湖群體和長江野生群體，亞群II包括武漢養(yǎng)殖群體和無錫養(yǎng)殖群體。這與吳旭等[7，8](2010)所研究的結(jié)果基本一致，本文研究結(jié)果顯示翹嘴鱖不同種群間的基因交流受到了一定的地理阻礙，特別是養(yǎng)殖群體與長江野生群體表現(xiàn)出較高的遺傳分化，一方面可能是內(nèi)陸湖泊和通江湖泊及長江之間，由于長期的江湖阻隔以及生境的不同，導(dǎo)致不同地理群體間逐漸產(chǎn)生形態(tài)或者分子的變異導(dǎo)致遺傳分化[22]；另一方面鱖魚野生資源逐漸減少，所產(chǎn)生的瓶頸效應(yīng)導(dǎo)致后代容易受到偶然因素的影響，加快群體間的分化速度。

綜上所述，基因交流的減少是造成鱖種群間遺傳分化的重要原因之一。建議加強鱖遺傳多樣性的監(jiān)測和評估，降低鱖野生遺傳資源的稀釋和衰退速度。以鱖遺傳背景為基礎(chǔ)，根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)制定合理的策略和科學(xué)的保護措施。從分子水平上分析種群系統(tǒng)地理格局的形成機制，追溯和揭示群體水平的進化歷史，防止人工繁殖的雜交子代對原始種的混雜與污染，在此基礎(chǔ)上制定系統(tǒng)的選育、保種方法，建立種資資源庫，使鱖類優(yōu)良的種質(zhì)資源得到合理的保護、開發(fā)及可持續(xù)利用。