初步探索DIM-C-pPhOH（NR4A1 拮抗劑）對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用及作用機制

徐楊熙 黃海韜 馬逸 王斌 王全才 李巖峰 周建波 董經(jīng)宇

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的侵襲性惡性腦腫瘤之一[1]。目前膠質(zhì)瘤的綜合治療取得了很大的進展，但在中位生存期和5 年生存率方面的改善微乎其微[2]。導(dǎo)致這種情況的主要原因是膠質(zhì)瘤的侵襲生長及放射治療、化學(xué)治療的不敏感性。因此，找尋可以限制膠質(zhì)瘤侵襲并抑制膠質(zhì)瘤增殖的藥物，并研究其作用機制，可以為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點。孤兒核受體4A1（nuclear receptor 4A1，NR4A1）在大腦亞細胞區(qū)域廣泛存在，為多巴胺能神經(jīng)元功能所必需的。受體基因家族NOR-1（NR4A3）、Nurr1（NR4A2）及Nur77（NR4A1）是由血清、生長因子、受體參與和誘導(dǎo)凋亡刺激的直接早期基因，具有相似的結(jié)構(gòu)特征，并且沒有已知的天然配體。由于其生理配體尚未被確定，被歸類為孤兒受體[3]。本文應(yīng)用NR4A1 拮抗劑（DIM-C-pPhOH）研究其在膠質(zhì)瘤細胞以及小鼠膠質(zhì)瘤模型中的作用。

材料與方法

一、主要藥物、試劑與儀器

DIM-C-pPhOH（純度98.96%，MCE 公司，美國）溶解于二甲基亞砜中，儲備液濃度10 mmol/L。CellTiter 檢測試劑[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]，超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），高速低溫離心機、臺式常溫離心機（Eppendorf 公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國）。

二、細胞系和細胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤U251 和U118 細胞株、鼠膠質(zhì)瘤GL261 細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，在含10%胎牛血清及100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的Dulbecco’s改良培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）中進行細胞培養(yǎng)，待貼壁生長至90%時使用胰蛋白酶消化傳代。

三、CellTiter 實驗檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期細胞，按3×103/100 μL 接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL，同時以培養(yǎng)基作為空白對照。37℃、5%CO2條件下過夜，棄原培養(yǎng)基，實驗組中分別加入含不同濃度DIM-C-pPhOH 培養(yǎng)基（終濃度為2.5、5、7.5、10、15、20、30 μmol/L），對照組中加入培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后，棄上清液，每孔加入50 μLCellTiter 反應(yīng)液，避光孵育15 min。酶標儀檢測各孔的吸光度（A）值，計算細胞的活性，細胞活性（%）=（實驗組平均A 值/對照組平均A 值）×100%。

四、抓痕實驗檢測U251 細胞遷移能力

U251 細胞以2×104接種于6 孔培養(yǎng)板中，過夜。用無菌的200 μL 移液管尖按標記位置刮出劃痕，并用分別含Hoest33342、10 μmol/L DIM-C-pPhOH 且無血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，保存在CO2培養(yǎng)箱中。分別于0、6、12 h 在熒光顯微鏡下拍攝劃痕。遷移率（%）=（剩余面積值/抓痕面積值）×100%。

五、3D-invasion 實驗檢測U251 細胞侵襲能力

取對數(shù)生長期U251 細胞，細胞以1.5×104/mL、20 μL 每滴接種到6 cm 無菌的培養(yǎng)皿蓋上，小心翻轉(zhuǎn)并于培養(yǎng)皿內(nèi)加入6 mL 磷酸緩沖鹽溶液。72 h后收集細胞球并接種96 孔板于含兔血膠原的培養(yǎng)基上。將DIM-C-pPhOH 以10 μmol/L 的濃度加入培養(yǎng)基，分別于0、6、12 h 拍攝細胞侵襲情況。侵襲率%=（細胞總面積-細胞核面積）/細胞核面積×100%。

六、免疫熒光實驗

取對數(shù)生長期GL261 細胞，細胞以3×103/100 μL接種到玻璃底面96 孔板，過夜，棄原培養(yǎng)基，分別于各孔中加入含5 ng/mL 轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），DIM-C-pPhOH 10 μmol/L及2 種因子都含有的DMEM 培養(yǎng)基50 μL。6 h 后棄去培養(yǎng)基并固定細胞。繼續(xù)對細胞核、NR4A1 蛋白進行染色后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察成像。

七、Western blot 檢測蛋白表達

不同濃度DIM-C-pPhOH（5、10 μmol/L）處理U251 細胞12 h 后，收集U251 細胞，用RIPA 裂解液裂解細胞蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定樣本蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入LC3B 抗體（1∶1000）、P62 抗體（1∶1000）、p-Akt 抗體（1∶500）、p-P70s6k 抗體（1∶500）、P70s6k（1∶1000）和β-actin（1∶1000），4℃孵育過夜，次日加入二抗（1∶2000），室溫孵育，增強化學(xué)發(fā)光法發(fā)光顯色檢測。

八、小鼠原位膠質(zhì)瘤模型治療

C57 雌性小鼠18 只，4～5 周齡，體質(zhì)量14～17 g購自北京維通利華實驗動物有限公司[實驗動物許可證號院SCXK（京）2012-0001]，飼養(yǎng)于溫度（21±2）℃，濕度40%～60%，換氣通風(fēng)12 次/h，12 h/12 h光暗交替。小鼠用50 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將動物俯臥位固定于小鼠腦立體定位儀上。用酒精消毒頭皮后，剪開頭皮，碘伏清潔切口，暴露顱骨。延前囟后2 mm，旁開右側(cè)1.5 mm，牙科鉆打孔。26 號微量注射器手動注射5 μL 細胞懸液（2×105個GL261 鼠源膠質(zhì)瘤細胞），進針深度3 mm，退針0.5 mm，注射時間約30 s。停針5 min 后，緩慢拔針，消毒縫合切口。模型構(gòu)建7 d 后，將麻醉以及接種問題死亡小鼠剔除，剩余小鼠隨機分成2 組，實驗組將DIM-C-pPhOH 溶解于溶劑中，按30 mg/kg 體質(zhì)量于接種后第7 天開始腹腔注射，對照組以相同劑量注射空白溶劑。分別于7、14、21 d 拍攝顱內(nèi)腫瘤熒光影像。

九、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，組間比較用ANOVA單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、DIM-C-pPhOH 可以抑制膠質(zhì)瘤細胞系的細胞活性

與對照組相比，DIM-C-pPhOH 可以顯著抑制3種膠質(zhì)瘤細胞系（U251、GL261、U118）的細胞活性，并且表現(xiàn)出濃度依賴性（圖1）。該化合物作用于3種細胞系48 h，IC50分別為5.76、6.87、9.93 μmol/L。

二、DIM-C-pPhOH 對U251 細胞侵襲和遷移能力的影響

與對照組相比，DIM-C-pPhOH 可明顯抑制U251 細胞的遷移能力和侵襲能力。以10 μmol/L DIM-C-pPhOH 處理24 h 后，可以明顯抑制U251 細胞遷移，與對照組比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。與對照組相比，用10 μmol/L 的DIM-C-pPhOH 處理U251 細胞球后6、12 h 均明顯抑制其侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖1 不同濃度DIM-C-pPhOH 對于不同膠質(zhì)瘤細胞系細胞活性的影響

圖2 DIM-C-pPhOH 作用12、24 h 后對U251 細胞系遷移作用的影響

三、DIM-C-pPhOH 對NR4A1 基因表達的影響

經(jīng)5 ng/mL TGF-β 處理后的U251 細胞可以誘導(dǎo)NR4A1 基因的出核表達，同時以TGF-β 5 ng/mL及DIM-C-pPhOH 10 μmol/L 處理后則僅有核內(nèi)表達（圖4）。

圖3 DIM-C-pPhOH 作用6、12 h 后對U251 細胞球的侵襲作用的影響

圖4 DIM-C-pPhOH 可以抑制TGF-β 誘導(dǎo)的NR4A1 基因出核表達

四、腹腔注射DIM-C-pPhOH 治療對小鼠膠質(zhì)瘤模型腫瘤大小以及生存曲線的影響

給藥期間，小鼠未見明顯消瘦、活動減少及飲食減少。腫瘤熒光影像顯示，實驗組腹腔注射DIM-CpPhOH 治療可以減緩小鼠膠質(zhì)瘤生長，而對照組腹腔注射空白溶劑則小鼠膠質(zhì)瘤生長較快，但2 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（第2 周：P=0.080；第3 周：P=0.108）。生存曲線分析顯示，腹腔注射DIM-C-pPhOH（30 mg/kg）治療與空白溶劑對照組相比，可以延長小鼠生存期（P=0.019）。具體信息見圖5。

五、DIM-C-pPhOH 對U251 細胞蛋白表達的影響

以DIM-C-pPhOH 10 μmol/L 處理U251 細胞24 h后，Western blot 實驗發(fā)現(xiàn)，DIM-C-pPhOH 可以明顯抑制Akt、P70S6K 蛋白表達，從而抑制PI3K/Akt/mTOR/p70s6k 通路，誘導(dǎo)細胞自噬發(fā)生，這可能是導(dǎo)致細胞最終死亡的機制（圖6）。

討論

據(jù)統(tǒng)計，2018 年有23 880 例新增神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤患者，其中16 380 例死亡。膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腦腫瘤，全球發(fā)病率為（0.59～3.69）/10 萬，因為涉及多個基因突變，所以成為難以治愈的高侵襲性腫瘤[4-5]。目前新診斷的膠質(zhì)瘤患者的標準治療包括手術(shù)、輔助放射治療和替莫唑胺（一種烷基化劑），但療效有限[6-7]。但高級別膠質(zhì)瘤具有侵及周圍正常腦組織的生物學(xué)特性和能力，可以巧妙地避開外科醫(yī)生的手術(shù)刀和根據(jù)手術(shù)范圍進行的放射治療。這些因為侵襲周圍正常腦組織而保留的膠質(zhì)瘤干細胞亞群是腫瘤復(fù)發(fā)和進展的主要原因，而且經(jīng)常表現(xiàn)出對放射治療和化學(xué)治療的抵抗能力，因此成為了導(dǎo)致患者死亡的主要原因。

孤核受體NR4A1 的表達受多種不同刺激誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞的增殖、存活、細胞周期、遷移和侵襲等，與代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、炎癥疾病相關(guān)。有研究表明，在胰腺、肺、結(jié)腸、腎臟和乳腺癌細胞系中，DIM-C-pPhOH（NR4A1 拮抗劑）通過失活NR4A1 依賴性核前癌通路來抑制細胞生長并誘導(dǎo)細胞死亡[8-11]。

圖5 DIM-C-pPhOH 對小鼠膠質(zhì)瘤模型腫瘤大小以及生存曲線

圖6 DIM-C-pPhOH 抑制U251 細胞PI3K/Akt/mTOR/p70s6k 信號通路，誘導(dǎo)細胞自噬發(fā)生

細胞自噬有著雙重作用，不但有抑制腫瘤形成的作用，同時還可以吞噬降解細胞器，為腫瘤細胞提供能量[12]。Western blot 結(jié)果表明，經(jīng)DIM-C-pPhOH處理過的膠質(zhì)瘤細胞表現(xiàn)出對U251 細胞PI3K/Akt/mTOR/p70s6k 信號通路的抑制作用并誘導(dǎo)細胞自噬，最終抑制細胞增殖，同時，DIM-C-pPhOH 還可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移及侵襲能力。一項近期的研究顯示，TGF-β 可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生遷移及侵襲，同時該研究表明導(dǎo)致這一現(xiàn)象的根本原因與NR4A1 基因相關(guān)[13]。在本研究中，TGF-β 可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞中NR4A1 基因的出核作用，而DIM-CpPhOH 則可以抑制這一過程。因此，DIM-C-pPhOH對于遷移以及侵襲的抑制作用可能與其對于乳腺癌的遷移抑制機制相類似[14-15]。

綜上所述，NR4A1 拮抗劑DIM-C-pPhOH 可以有效地抑制膠質(zhì)瘤細胞系的增殖、遷移及侵襲，為臨床治療膠質(zhì)瘤提供了潛在的可能性。本研究僅初步探索了DIM-C-pPhOH 對于膠質(zhì)瘤細胞系的抑制作用，提出其作用機制很可能與自噬相關(guān)，而其中涉及的生物信號傳導(dǎo)通路及具體作用機制仍需進一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突