常壓蒸制法炮制草烏的質(zhì)量研究

王芳靜，楊紫瑩，金傳山，張 偉，唐傳華，于 杰

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽省萬(wàn)生中藥飲片有限公司，安徽 阜陽(yáng) 236112；3.安徽省中藥飲片炮制加工工程研究中心，安徽 阜陽(yáng) 236112)

制草烏為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)干燥塊根的炮制加工品，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛等功效[1]。通過(guò)加水、加熱等炮制工藝處理后，可使生草烏中極毒的雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的單酯型生物堿，并可進(jìn)一步水解后，轉(zhuǎn)化成親水性氨基醇類烏頭原堿，毒性大大降低，而療效仍存[2-4]。制草烏的炮制方法眾多，如煮制、蒸制、黑豆制、甘草制、訶子制[5]，目前多采用《中華人民共和國(guó)藥典》收載的常壓水煮法。然而研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的浸泡、水煮后，不僅會(huì)造成草烏中雙酯型生物堿水解過(guò)多以及總生物堿流失嚴(yán)重[6-7]，影響其臨床使用的藥效，且生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多的煮制廢水，若不經(jīng)減毒處理直接排入環(huán)境中，不僅對(duì)環(huán)境中動(dòng)植物產(chǎn)生危害，最終可能也會(huì)危害人類健康。在產(chǎn)業(yè)化實(shí)際生產(chǎn)中，常壓蒸制法較《中華人民共和國(guó)藥典》水煮法有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、節(jié)能、減少水污染及能較大限度地保留有效成分等優(yōu)勢(shì)而同時(shí)存在，但是由于常壓蒸制法相關(guān)炮制資料較少，對(duì)其主要影響因素缺乏系統(tǒng)的考察，評(píng)價(jià)指標(biāo)單一等，制草烏飲片質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響到臨床用藥的安全性。本試驗(yàn)擬采用L9(33)正交試驗(yàn)法對(duì)常壓蒸制生產(chǎn)制草烏的主要影響因素進(jìn)行考察，并且與2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》制草烏項(xiàng)下水煮法生產(chǎn)的制草烏進(jìn)行比較，以草烏中雙酯型生物堿、單酯型生物堿的含量及炮制品的外觀評(píng)分為指標(biāo)優(yōu)選制草烏常壓蒸制工藝，以期建立一個(gè)“減毒存效”、工藝可操作性強(qiáng)的炮制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；400A多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；AUW120D百萬(wàn)分之一精密天平：日本島津；FR224CN電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；VP-1旋片式真空泵：浙江省臺(tái)州正空泵業(yè)有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州潤(rùn)華電器有限公司；德國(guó)IKA RV 3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JK-300DVB三頻數(shù)控超聲波清洗器：安徽省合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；BGZ-140博迅電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試藥 烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)900100-170731，純度≥98.0%)、次烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)900101-161213，純度≥98.0%)、新烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)900102-161215，純度≥97.8%)、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào)900103-181002，純度≥98.0%)、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào)900105-180331，純度≥96.0%)、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào)900104-180528，純度≥95.3%)：均購(gòu)自江蘇省永健醫(yī)藥科技有限公司；乙腈、四氫呋喃為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。生草烏(產(chǎn)地四川，批號(hào) Y180622)由安徽省萬(wàn)生中藥飲片有限公司提供，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 6種烏頭類生物堿含量測(cè)定 按照文獻(xiàn)[1,8]方法測(cè)定生物堿含量。

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取烏頭堿5.29 mg、次烏頭堿5.29 mg、新烏頭堿5.28 mg、苯甲酰烏頭原堿5.41 mg、苯甲酰次烏頭原堿5.20 mg、苯甲酰新烏頭原堿5.57 mg，分別加至5 mL容量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得對(duì)照品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ貯備液。分別從上述對(duì)照品貯備溶液中精密吸取0.35、0.15、0.50、0.25、1.00、0.80 mL至10 mL容量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25 ℃以下)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)尤氘惐?三氯甲烷(1∶1)混合溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動(dòng)相A，以0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動(dòng)相B；梯度洗脫(0～48 min，15%～26% A；48～48.1 min，26%～35% A；48.1～58 min，35% A；58～65 min，35%～15% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，按此色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。各成分分離度均大于1.5；理論板數(shù)按苯甲酰新烏頭原堿計(jì)算大于8 000；信噪比大于10；拖尾因子T為0.95～1.05；采用外標(biāo)法，對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，其峰面積測(cè)量值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%。色譜圖見圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.生草烏；C.《中華人民共和國(guó)藥典》水煮法制草烏；D.常壓蒸制法制草烏；

1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰烏頭原堿；3.苯甲酰次烏頭原堿；4.新烏頭堿；5.次烏頭堿；6.烏頭堿

圖1 草烏的高效液相色譜圖

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品適量，加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液定容，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，逐級(jí)稀釋至對(duì)應(yīng)濃度，精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以6種生物堿對(duì)照品的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=180.07ρ+0.541 5(r=0.999 9)；線性范圍：13.2～211.6 μg。次烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=125.03ρ+1.205 3(r=0.999 6)；線性范圍：26.5～423.2 μg。新烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=86.925ρ+5.584 8(r=0.999 8);線性范圍：149.4～2 390.0 μg。苯甲酰烏頭原堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=112.16ρ-0.018 6(r=0.999 5)；線性范圍：1.3～20 μg。苯甲酰次烏頭原堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=131.14ρ-0.013 6(r=0.999 5)；線性范圍：1.8～28.9 μg。苯甲酰新烏頭原堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=87.27ρ+0.227(r=0.999 8)；線性范圍：11.1～178.2 μg。

2.2 常壓蒸制法工藝的研究

2.2.1 炮制工藝的優(yōu)選 考察3個(gè)試驗(yàn)因素，分別為浸泡時(shí)間(3、4、5 d對(duì)應(yīng)的水平分別為1、2、3)、蒸制時(shí)間(6、7、8 h對(duì)應(yīng)的水平分別為1、2、3)、干燥溫度(50、60、70 ℃對(duì)應(yīng)的水平分別為1、2、3)。取大小均勻的生草烏樣品9份，每份500 g，按照L9(33)正交表(見表1)的順序進(jìn)行炮制，取出晾涼，切薄片，置于鼓風(fēng)干燥箱中干燥，即得。

表1 L9(33)正交表

2.2.2 綜合評(píng)分值的確定 本試驗(yàn)對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行“隸屬度”計(jì)算，對(duì)于欲達(dá)到最大值的指標(biāo)(如單酯型生物堿含量和外觀評(píng)分)，其指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)值-指標(biāo)最小值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)；對(duì)于限量指標(biāo)(如雙酯型生物堿含量)，其指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)最大值-指標(biāo)值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)?？梢?，指標(biāo)最大值的隸屬度為1，而限量指標(biāo)的隸屬度為0，所以0≤指標(biāo)隸屬度≤1[9-10]。為確保草烏的安全性和有效性并存，既要提高單酯型生物堿的含量，也要避免雙酯型生物堿的全部流失、水解，同時(shí)需考慮到飲片外觀性狀。因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)其炮制品的權(quán)重為總單酯型生物堿占45%，總雙酯型生物堿占35%，外觀評(píng)分占20%。綜合評(píng)分=總單酯型生物堿含量的隸屬度×45%+總雙酯型生物堿總含量的隸屬度×35%+炮制品外觀評(píng)分的隸屬度×20%，滿分為1.00。

本試驗(yàn)對(duì)制草烏飲片的外觀評(píng)分進(jìn)行規(guī)定，滿分為5分。其中色澤分為“黑褐色”(5分)、“淡黑褐色”(3分)、“灰褐色”(1分)；質(zhì)地分為“質(zhì)地實(shí)，質(zhì)脆”(5分)、“質(zhì)地實(shí)，較為脆”(3分)、“質(zhì)較軟”(1分)；氣味分為“氣微，微有麻舌感”(5分)、“氣微，有麻舌感”(3分)、“氣微，麻舌感強(qiáng)烈”(1分)。正交試驗(yàn)綜合評(píng)分結(jié)果見表2，極差分析結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

2.2.3 試驗(yàn)結(jié)果分析 采用一般線性模型分析3個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)綜合評(píng)分的主效應(yīng)，方差分析結(jié)果(見表4)顯示，影響制草烏常壓蒸制因素的主次順序?yàn)檎糁茣r(shí)間、干燥溫度、浸泡時(shí)間，其中蒸制時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過(guò)綜合分析確定制草烏常壓蒸制的最佳工藝：生草烏用常溫(25 ℃)水浸泡4 d后，隔水蒸制8 h，取出晾涼，切薄片，置于70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥。

表4 試驗(yàn)因素對(duì)綜合評(píng)分影響的方差分析結(jié)果

2.2.4 最佳工藝驗(yàn)證 為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性，均勻稱取生草烏3份，每份500 g，按正交試驗(yàn)得出的最佳工藝方法進(jìn)行炮制試驗(yàn)，對(duì)炮制品中雙酯型、單酯型生物堿進(jìn)行測(cè)定，含量測(cè)定方法同前，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，制草烏常壓蒸制品的雙酯型生物堿包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的總含量為0.004 9%～0.006 8%，單酯型烏頭堿包括苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿的總含量為0.044 8%～0.056 7%，符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的制草烏標(biāo)準(zhǔn)。

表5 常壓蒸制工藝驗(yàn)證結(jié)果(n=3)

注：樣品A為生草烏；B1～B3為3批常壓蒸制的制草烏，烏頭堿成分均未測(cè)出，外觀評(píng)分均為13。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同進(jìn)樣容積對(duì)高效液相色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣容積為6～10 μL時(shí)，色譜峰前延嚴(yán)重；進(jìn)樣容積為5 μL時(shí)，主要色譜峰的分離度和峰型均達(dá)到最佳，基線也較平穩(wěn)，噪音干擾較少。草烏經(jīng)合理炮制后由于雙酯型烏頭堿類成分的分解破壞而使其毒性降低，鎮(zhèn)痛、抗炎作用仍然很明顯，但若炮制太過(guò)，水解全無(wú)，則藥效降低，所以應(yīng)適當(dāng)保留雙酯型生物堿更為合理[8，11-12]。本實(shí)驗(yàn)選擇以“減毒存效”為目標(biāo)，以單酯型生物堿占評(píng)分的45%，雙酯型生物堿占評(píng)分的35%，外觀性狀占評(píng)分的20%的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，對(duì)常壓蒸制法的制草烏進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》制草烏項(xiàng)下對(duì)其6種生物堿的含量規(guī)定為雙酯型生物堿含量不高于0.040%，單酯型生物堿含量為0.020%～0.070%。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生草烏雙酯型生物堿含量為0.358 8%，單酯型生物堿含量為0.029 1%；《中華人民共和國(guó)藥典》水煮法制草烏雙酯型生物堿含量為0.002 2%，單酯型生物堿含量為0.036 2%；常壓蒸制法制草烏雙酯型生物堿含量為0.004 9%～0.006 8%，單酯型生物堿含量為0.044 8%～0.056 7%，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》的限量要求。與生草烏相比，草烏經(jīng)過(guò)加水、加熱處理后，極毒的雙酯型生物堿明顯水解減少，單酯型生物堿明顯增加；與《中華人民共和國(guó)藥典》水煮法制草烏相比，常壓蒸制法制草烏的單、雙酯型生物堿總量均高于《中華人民共和國(guó)藥典》水煮法，這表明常壓蒸制法可以在達(dá)到減毒的同時(shí)能夠較大限度地保留草烏中有效成分。

目前草烏的軟化方式主要為清水浸泡法，由于四季溫差較大，致使草烏藥材“浸泡至內(nèi)無(wú)干心”所需的時(shí)間不固定，一般為2～7 d，且浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或水溫過(guò)高極易出現(xiàn)霉變現(xiàn)象。制草烏的《中華人民共和國(guó)藥典》水煮法沒有具體的工藝參數(shù)，主要依靠傳統(tǒng)炮制經(jīng)驗(yàn)控制炮制程度，實(shí)驗(yàn)室前期以《中華人民共和國(guó)藥典》的方法為基礎(chǔ)研究并確定了常壓煮制法的工藝，即在常溫下(25 ℃)浸泡5 d，常壓下加水煮6 h，取出晾涼，切薄片，置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，即得。本試驗(yàn)優(yōu)選出草烏常壓蒸制工藝，僅需在常溫(25 ℃)下浸泡4 d，隔水蒸制8 h，置于70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，即得。與《中華人民共和國(guó)藥典》水煮法比較，本試驗(yàn)優(yōu)選出的常壓蒸制工藝大大縮短了工時(shí)，減少了煮制廢水的產(chǎn)生，并且避免了草烏浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或水溫過(guò)高導(dǎo)致發(fā)霉現(xiàn)象及生物堿的大量流失，減毒效果好，有效成分含量高，是一種較理想且可適用于產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)的炮制方法。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果也表明，該制草烏炮制工藝的重復(fù)性較好，具有一定的可行性。