高通量測(cè)序在重癥肺部感染患者中的應(yīng)用效果

任迪 李穎 曾晶晶

[摘要] 目的 探討高通量測(cè)序技術(shù)在重癥肺部感染患者中的應(yīng)用效果。 方法 回顧性分析2018年1～12月廣東省深圳市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的87例重癥肺部感染患者的臨床資料。采用數(shù)字隨機(jī)表法分為應(yīng)用高通量測(cè)序患者下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）組43例，對(duì)照組44例。比較NGS組病原體檢出率，兩組患者抗生素使用強(qiáng)度，重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）住院天數(shù)及28 d病死率。 結(jié)果 兩組患者治療前基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。NGS組中高通量肺泡灌洗液標(biāo)本中病原體檢出率明顯高于常規(guī)培養(yǎng)，NGS組抗生素使用強(qiáng)度低于對(duì)照組，ICU住院時(shí)間短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩組患者28 d病死率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用能提高重癥肺部感染患者肺泡灌洗液病原體的檢出率，降低抗生素使用強(qiáng)度及縮短住院時(shí)間。

[關(guān)鍵詞] 高通量測(cè)序;重癥肺部感染;抗生素使用強(qiáng)度;宏基因組學(xué);下一代測(cè)序技術(shù)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R563? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）03（a）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of high-throughput sequencing technology in patients with severe pulmonary infection. Methods A retrospective analysis of the clinical data of 87 patients with severe pulmonary infection were admitted to the Department of Critical Medicine， Shenzhen Second People′s Hospital from January to December 2018. Random table method was used to divide 43 cases of next generation sequencing （NGS） group and 44 cases of control group. The pathogen detection rate in the NGS group， the intensity of antibiotic use， the number of days in the intensive care unit （ICU）， and the 28-day mortality of two groups were compared. Results There was no significant difference in baseline data of patients between the two groups before treatment （P > 0.05）. The detection rate of high-throughput pathogens in the NGS group was significantly higher than that of conventional culture， the intensity of antibiotic use in the NGS group was lower than that in the control group， and the ICU hospital stay was shorter than that in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in the 28 days mortality between the two groups （P > 0.05）. Conclusion The application of high-throughput sequencing technology can improve the detection rate of alveolar lavage fluid pathogens in patients with severe pulmonary infection， reduce the intensity of antibiotic use and shorten the length of hospitalization.

[Key words] High-throughput sequencing; Severe pulmonary infection; Antibiotics use density; Metagenomics; Next generation sequencing technology

重癥肺部感染患者是感染性疾病的主要組成部分，病情復(fù)雜、病死率高[1]，需要及時(shí)有效地抗感染治療。在無(wú)病原學(xué)前提下，臨床醫(yī)生根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選用抗生素，同時(shí)送標(biāo)本做微生物涂片及培養(yǎng)，待結(jié)果回報(bào)后決定是否調(diào)整抗生素。因常規(guī)微生物培養(yǎng)陽(yáng)性率低且容易受多種不確定因素影響，這將可能導(dǎo)致抗生素多用、濫用，及時(shí)找出致病微生物是感染性疾病治療的關(guān)鍵。高通量測(cè)序技術(shù)又稱(chēng)下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）是新型病原檢測(cè)手段，有快速、精準(zhǔn)、陽(yáng)性率高等特點(diǎn)，非常適合病原體診斷[2]。本研究回顧性分析NGS的重癥肺部感染患者病原體檢出率、抗生素使用強(qiáng)度及住院時(shí)間，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年1～12月廣東省深圳市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的符合入選排除標(biāo)準(zhǔn)的87例重癥肺部感染患者的臨床資料。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲;②符合《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》[3]2016版本中的重癥肺部感染診斷;③應(yīng)用抗生素前已留取了肺泡灌洗液及血樣本;④病程中有根據(jù)NGS結(jié)果進(jìn)行了抗生素調(diào)整記錄;⑤患者或其家屬已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期婦女;②急性生理與慢性健康評(píng)分（APACHE Ⅱ）>35分或<15分;③合并肺外感染;④送檢樣本的微生物核酸含量<100 copies/mL。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，應(yīng)用高通量測(cè)序患者NGS組43例及對(duì)照組44例，兩組患者年齡、APACHE Ⅱ評(píng)分、簡(jiǎn)化臨床肺部感染評(píng)分（CPIS）[4]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2 方法

兩組患者均給予經(jīng)驗(yàn)性抗感染、必要的呼吸機(jī)輔助通氣、早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及臟器功能支持等綜合治療，應(yīng)用抗生素前收集患者外周血樣本2份和肺泡灌洗液樣本2份，同時(shí)送醫(yī)院微生物培養(yǎng)以及華大基因臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)行高通量病原體檢測(cè)（BGISEQ-50平臺(tái)）。樣本量：醫(yī)院微生物培養(yǎng)需要外周靜脈血2套（需氧瓶+厭氧瓶，各2瓶，每瓶10 mL）及肺泡灌洗液樣本至少10 mL，均及時(shí)送檢;高通量測(cè)序樣本需要外周靜脈血至少2 mL，DNA試管常溫暫存，肺泡灌洗液至少需要采集5 mL，4～20℃暫存，2 h內(nèi)送檢，如不能及時(shí)送檢，血樣本常溫保存，肺泡灌洗液-20℃保存，24 h內(nèi)均能送檢。

1.2.1 高通量檢測(cè)陽(yáng)性判定方法

參照日本名古屋大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究判定的方法，細(xì)菌的判定要求Reads>200，同時(shí)P1（占所有微生物的比例）>0.5[5]。

1.2.2 高通量檢測(cè)微生物致病與定植的判定方法

結(jié)合臨床，如患者有發(fā)熱、炎性指標(biāo)升高、痰液性狀改變及影像學(xué)改變，判為致病菌;如無(wú)臨床感染征象，判為定植菌。

1.2.3 抗生素調(diào)整方案

均需與臨床相結(jié)合。

1.2.3.1 NGS組? 陽(yáng)性：根據(jù)測(cè)序出的病原體針對(duì)性調(diào)整抗生素為單藥窄譜;陰性：繼續(xù)經(jīng)驗(yàn)性用藥。

1.2.3.2 對(duì)照組? 根據(jù)臨床培養(yǎng)結(jié)果決定是否調(diào)整抗生素。

1.2.4 治療終點(diǎn)臨床治愈、出科。

1.3 觀察指標(biāo)兩組患者病原體檢出率、抗生素使用強(qiáng)度、重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）住院天數(shù)、28 d病死率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGS組兩種檢測(cè)方法病原體檢出率比較

肺泡灌洗液標(biāo)本中，高通量病原體檢出率明顯高于常規(guī)培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P < 0.05）;血標(biāo)本中，高通量與常規(guī)培養(yǎng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 兩組患者抗生素使用情況比較

NGS組抗生素使用強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;其中碳青霉素類(lèi)抗生素使用人數(shù)及使用強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 兩組患者ICU住院天數(shù)及28 d病死率比較

NGS組ICU住院天數(shù)明顯短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;兩組患者28 d病死率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)是近十余年發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，2014年首次被報(bào)道用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染鉤端螺旋體的病例[6]。該方法可以快速對(duì)樣本中全部DNA或RNA進(jìn)行測(cè)序[7-8]。該技術(shù)也已經(jīng)被報(bào)道用于血流感染[9]、呼吸道[10]、中樞神經(jīng)[11]膿腫液、局灶組織[12]等不同標(biāo)本類(lèi)型的病原體檢測(cè)?，F(xiàn)已逐漸應(yīng)用于重癥患者的病原微生物的檢測(cè)中，理論上具有高效、準(zhǔn)確及檢出未知病原體的特點(diǎn)。2019年2月發(fā)布的《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專(zhuān)家共識(shí)》[13]中肯定了高通量測(cè)序技術(shù)在危重癥患者病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。針對(duì)重癥肺部感染病原體進(jìn)行高通量測(cè)序的研究，經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，僅有少量相關(guān)研究發(fā)表，Li等[14]針對(duì)重癥感染患者進(jìn)行高通量檢測(cè)病原體的研究中提示，血及肺泡灌洗液樣本的NGS組病原檢出率均明顯高于常規(guī)培養(yǎng)組。Xie等[15]研究中也提示，應(yīng)用了NGS的重癥肺部感染患者可以早期明確病原菌，細(xì)菌陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，28 d和90 d死亡率明顯低于對(duì)照組。Pan等[16]在免疫功能低下的社區(qū)獲得性肺部感染13例患者研究提示，NGS在病毒和真菌檢測(cè)領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢(shì)，而在細(xì)菌檢測(cè)方面未顯示出優(yōu)勢(shì)。劉孝榮等[17]在針對(duì)兒童重癥肺部感染肺泡灌洗液應(yīng)用NGS檢測(cè)病原體的研究中提示，NGS組靈敏度高（86.84%），能檢出未知病原體，優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床檢驗(yàn)方法。本研究中NGS組中高通量病原體檢出率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)，NGS組陽(yáng)性的樣本中檢出的病原菌有肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌、乳糖奈瑟球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、棒狀桿菌、黏液羅氏菌等，還有部分沒(méi)有免疫功能障礙基礎(chǔ)疾病的患者檢測(cè)出較高序列數(shù)的人類(lèi)皰疹病毒5型（CMV）、人類(lèi)皰疹病毒4型（EB病毒）?？紤]可能與重癥患者免疫功能受到影響有關(guān)，未檢出真菌及原蟲(chóng)，可能與真菌細(xì)胞壁較厚，DNA胞外釋放量少有關(guān)，而常規(guī)培養(yǎng)方法僅檢出常見(jiàn)微生物。在不明確致病微生物前提下，臨床醫(yī)生往往給予經(jīng)驗(yàn)性的廣譜抗生素治療。有研究提示[18]，相對(duì)于有明確致病菌而進(jìn)行的針對(duì)性窄譜抗生素治療，并不能顯著改善臨床癥狀及預(yù)后且并發(fā)癥明顯增高，NGS是實(shí)現(xiàn)感染性疾病精準(zhǔn)治療、避免抗生素濫用的關(guān)鍵技術(shù)之一[19]。然而，通過(guò)NGS結(jié)果指導(dǎo)臨床抗生素的應(yīng)用研究較少，本研究根據(jù)理論依據(jù)，應(yīng)用NGS指導(dǎo)抗生素的應(yīng)用，取得了一定的效果。本研究結(jié)果顯示，NGS組抗生素使用強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。在患者28 d死亡率評(píng)價(jià)中，本研究數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Xie等[15]研究不一致，可能與疾病嚴(yán)重程度、樣本量不同等因素有關(guān)。

目前針對(duì)高通量測(cè)序檢測(cè)病原體的結(jié)果判定還尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)或共識(shí)，Somasekar等[20]自定義mNGS的判讀標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)要求每百萬(wàn)映射讀取的Reads（rpm）≥陰性對(duì)照的10倍，病毒Reads≥20，同時(shí)覆蓋度>2%。Zinter等[21]將所有微生物以同一標(biāo)準(zhǔn)劃分，要求rpm≥10同時(shí)自定義的Z評(píng)分≥2分。Simner等[22]在腦脊液病原體測(cè)序中沿用了以上的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)認(rèn)為致病原應(yīng)排在所有微生物的前5名。Grumaz等[23]設(shè)計(jì)出SIQ評(píng)分試圖找到更接近感染的Reads數(shù)。國(guó)內(nèi)有部分研究[8，24]，判定標(biāo)準(zhǔn)也尚不統(tǒng)一。本研究中仍在一些不足之處，本研究所采用的日本名古屋大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究的判定方法是否合適仍需要進(jìn)一步探討，NGS陽(yáng)性的病原菌也未進(jìn)行PCR驗(yàn)證?，F(xiàn)階段我們正在進(jìn)行重癥感染患者常見(jiàn)不同細(xì)菌感染的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)的序列研究。

綜上所述，NGS是一種新型檢測(cè)致病微生物的方法，本研究中提高病原體的檢出率，減少抗生素的使用強(qiáng)度及住院天數(shù)，臨床應(yīng)用中仍有較多的不足之處，需要開(kāi)展更多的相關(guān)研究。

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