甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達(dá)及其與Th17/Treg的相關(guān)性分析

周偉清，莊一心，沈衛(wèi)星，沈育鋒，章平

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，女性發(fā)病率遠(yuǎn)高于男性。大多數(shù)甲狀腺癌患者預(yù)后良好，治療后生存率高，但部分未分化癌預(yù)后極差。雖然關(guān)于甲狀腺癌影響因素研究較多，但由于近年來人們飲食結(jié)構(gòu)、生活環(huán)境惡化、遺傳、肥胖等因素影響，甲狀腺癌發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響人類生存質(zhì)量[1]。因此繼續(xù)探尋甲狀腺癌進(jìn)展中相關(guān)因子及指標(biāo)仍有重要意義。Shan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中l(wèi)et-7e顯著低于癌旁組織，可能與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)，下調(diào)let-7e可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、體外血管生成和腫瘤生長。有研究表明，let-7e在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，可能與患者生存率有關(guān)[3]。miR-142在肝癌組織中低表達(dá)，過表達(dá)miR-142可明顯誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。胡潺潺等[4]研究報(bào)道，乳腺癌組織和細(xì)胞中miR-142表達(dá)下調(diào)，與癌細(xì)胞侵襲性有關(guān)，上調(diào)miR-142表達(dá)可抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移[5]。由于輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)水平與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，且甲狀腺癌中l(wèi)et-7e、miR-142表達(dá)水平及與Th17/Treg關(guān)系未見報(bào)道，因此本研究通過檢測(cè)甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達(dá)水平及患者外周血Th17/Treg水平，分析let-7e、miR-142表達(dá)與Th17/Treg水平關(guān)系，以期為甲狀腺癌患者臨床治療和預(yù)后改善提供一定理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月—2019年6月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院普外科收治的甲狀腺癌患者(甲狀腺癌組)109例，其中男41例，女68例，年齡28～65(47.25±9.87)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床及病理組織切片檢查確診為甲狀腺癌；(2)患者入組前未進(jìn)行任何治療；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并患有其他部位腫瘤者；(2)心臟、腎臟、肝臟等功能嚴(yán)重不全者；(3)患有嚴(yán)重精神疾病者。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)TNM分期系統(tǒng)[6]將入組患者分為：Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ期53例；根據(jù)病理分型分為：乳頭狀癌83例，濾泡型癌10例，未分化癌9例，髓樣癌7例；根據(jù)是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例。另選取同期在醫(yī)院健康體檢者109例作為健康對(duì)照組，其中男43例，女66例；年齡29～63(48.03±8.96)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 (1)主要試劑：總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(日本Takara公司)。主要儀器：qRT-PCR儀(ABI 7500，美國ABI公司)；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX，美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集： 甲狀腺癌組患者和健康對(duì)照組分別于入組后和體檢時(shí)(07∶00～09∶00)空腹采集外周靜脈血5 ml，3 ml在4℃、3 000 r/min條件下離心15 min，用于qRT-PCR和ELISA試驗(yàn)，2 ml用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.3.2 血清let-7e、miR-142表達(dá)水平檢測(cè)： 使用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。20 μl反應(yīng)體系如下，10 μl SYBR2Taq Ⅱ，2 μl cDNA，0.4 μl ROX，0.8 μl上游引物，0.8 μl下游引物，ddH2O 6.0 μl。qRT-PCR反應(yīng)步驟如下，95℃、35 s，1循環(huán)；95℃、5 s；63℃、34 s，38循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，用2-△△CT法計(jì)算let-7e、miR-142表達(dá)水平，所用引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17及Treg細(xì)胞水平: 取入組者外周血5 ml，加入PBS緩沖液混勻后滴入裝有10 ml ficoll分離液離心管中，離心后取中層單個(gè)核細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)。將所得單個(gè)核細(xì)胞稀釋到相應(yīng)濃度后于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。收集培養(yǎng)后細(xì)胞，分成2份，分別加入相應(yīng)單抗，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。以CD4+IL-17+在CD4+T細(xì)胞中百分比表示Th17水平，CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中百分比表示Treg細(xì)胞水平。

1.3.4 血清相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測(cè): 采用ELISA法檢測(cè)白介素10(IL-10)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)、白介素6(IL-6)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，試劑盒購自上海群己生物科技有限公司。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清中l(wèi)et-7e、miR-142表達(dá)水平比較 甲狀腺癌組患者血清中l(wèi)et-7e、miR-142表達(dá)水平均顯著低于健康對(duì)照組(P均<0.01)，見表2。

表2 2組受試者let-7e、miR-142表達(dá)水平比較

2.2 2組外周血Th17、Treg細(xì)胞比例比較 甲狀腺癌組患者外周血Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg均顯著高于健康對(duì)照組(P均<0.01)，見表3。

表3 2組受試者Th17、Treg細(xì)胞比例比較

2.3 血清let-7e、miR-142及外周血Th17/Treg與甲狀腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 let-7e、miR-142及Th17/Treg水平與甲狀腺癌患者性別、年齡、腫瘤直徑和病理分型無關(guān)(P均>0.05)，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.01)，見表4。

2.4 2組血清Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 甲狀腺癌患者血清IL-10、IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平顯著高于健康對(duì)照組(P均<0.01)，見表5。

2.5 甲狀腺癌患者let-7e、miR-142表達(dá)與Th17/Treg水平相關(guān)性分析 甲狀腺癌患者血清let-7e表達(dá)水平與外周血Th17/Treg水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.337，P=0.000)，血清miR-142表達(dá)水平與外周血Th17/Treg水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.402，P=0.000)，見圖1、圖2。

2.6 甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達(dá)與細(xì)胞因子相關(guān)性分析 甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達(dá)水平與IL-6無關(guān)(P>0.05)，與IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.01)，見表6。

表4 let-7e、miR-142及Th17/Treg水平與甲狀腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表5 2組血清Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

圖1 甲狀腺癌患者let-7e與Th17/Treg水平相關(guān)性

圖2 甲狀腺癌患者miR-142與Th17/Treg水平相關(guān)性

表6 甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達(dá)與細(xì)胞因子相關(guān)性分析

細(xì)胞因子let-7er值P值miR-142r值P值IL-10-0.4350.000-0.5070.000IL-17-0.3270.001-0.4040.000IL-23-0.3920.000-0.4530.000IL-6-0.2010.087-0.2130.076TG-β-0.3760.000-0.4270.000

3 討 論

甲狀腺癌早期表現(xiàn)為頸部甲狀腺出現(xiàn)非對(duì)稱性腫塊、咽喉有壓抑感、頸部疼痛等，但由于早期癥狀無典型性特征，甲狀腺癌易進(jìn)展至中晚期。中晚期甲狀腺癌患者出現(xiàn)呼吸不暢、吞咽困難、頸部放射痛、淋巴結(jié)腫大、轉(zhuǎn)移至其他部位引起其他器官病變，嚴(yán)重威脅患者生存[7]。甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中相關(guān)影響因子仍是甲狀腺癌研究重要部分。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類短鏈非編碼RNA，能參與多種疾病調(diào)控。研究表明，miR-126-3p在甲狀腺癌組織中表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，上調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡[8]。Bai等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在甲狀腺癌組織中明顯下調(diào)，體外過表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯，提示多種miRNA可參與調(diào)控甲狀腺癌進(jìn)展。

有研究報(bào)道，miRNA家族成員let-7e在上皮性卵巢癌中低表達(dá)，與患者無進(jìn)展生存率較差有關(guān)[10]。本研究結(jié)果中，甲狀腺癌患者血清let-7e表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組，與Xiao等[10]研究結(jié)果相似，提示患者血清中l(wèi)et-7e表達(dá)水平可能與甲狀腺癌發(fā)生有關(guān)。Gong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，let-7e在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)低于正常腦組織，let-7e可通過抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者血清let-7e表達(dá)水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示let-7水平可能與甲狀腺癌發(fā)展有關(guān)。

Lu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織和細(xì)胞系中miR-142表達(dá)顯著下調(diào)，參與胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲調(diào)控。研究表明，miR-142在食管鱗癌組織中明顯低于癌旁組織，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者預(yù)后有關(guān)[13]。另有研究報(bào)道，miR-142在胃癌組織中低表達(dá)，可抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲，與患者復(fù)發(fā)等不良預(yù)后有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，甲狀腺癌患者血清miR-142表達(dá)水平顯著降低，與Yan等[14]在胃癌中研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-142表達(dá)與甲狀腺癌患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-142可能參與甲狀腺癌進(jìn)展。

Th17細(xì)胞能分泌IL-17，通過促進(jìn)炎性反應(yīng)參與機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者外周血Th17細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照組，與非小細(xì)胞肺癌臨床分期有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者外周血Th17細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照組，提示外周血Th17細(xì)胞比例升高可能與甲狀腺癌發(fā)展有關(guān)。Treg細(xì)胞能維持機(jī)體免疫耐受，通過抑制免疫反應(yīng)維持免疫系統(tǒng)平衡。研究表明，非小細(xì)胞肺癌組織中Treg浸潤明顯高于癌旁組織，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[16]。本研究結(jié)果中，甲狀腺癌患者外周血Treg細(xì)胞比例顯著升高，提示外周血Treg細(xì)胞比例異?？赡苡绊懠谞钕侔┌l(fā)生發(fā)展。另外，研究報(bào)道，與健康對(duì)照組相比，非小細(xì)胞肺癌患者Th17/Treg比值明顯升高，可能影響癌細(xì)胞分化[17]。李清靖等[18]發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血Th17/Treg明顯升高，與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者外周血Th17/Treg比值明顯高于健康對(duì)照組，且與TNM分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示甲狀腺癌患者體內(nèi)Th17/Treg平衡被打破，可能影響甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展。

Navarro等[19]研究表明，Th17細(xì)胞因子IL-17可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，可能與腫瘤進(jìn)展及患者預(yù)后有關(guān)。Th17可通過調(diào)控IL-23及IL-6促進(jìn)結(jié)腸癌及大腸癌進(jìn)展[20-21]。劉勇等[22]發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞與TGF-β、IL-10水平呈正相關(guān)，共同參與肝癌患者體內(nèi)免疫調(diào)控過程。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者血清中與Th17/Treg相關(guān)因子IL-10、IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平顯著升高，提示Th17/Treg比例失衡可能導(dǎo)致相關(guān)因子水平異常，影響甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者血清let-7e、miR-142表達(dá)水平與外周血Th17/Treg水平及其相關(guān)因子IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β水平呈負(fù)相關(guān)，提示let-7e、miR-142可能通過調(diào)控Th17/Treg比值影響相關(guān)細(xì)胞因子水平，在甲狀腺癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。

綜上所述，與健康對(duì)照組相比，甲狀腺癌患者血清let-7e與miR-142表達(dá)水平下調(diào)，Th17/Treg水平上調(diào)，與患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且血清let-7e、miR-142表達(dá)水平與Th17/Treg及其相關(guān)因子水平均呈負(fù)相關(guān)，提示let-7e、miR-142與Th17/Treg之間可能存在調(diào)控機(jī)制，共同參與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展。但由于本研究樣本量較少、研究方法較為單一，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

周偉清：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；莊一心：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；沈衛(wèi)星：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；沈育鋒：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；章平：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫