耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌耐藥基因分析

伍啟康，李小燕，吳奎海，李煒煊△

1.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510182

陰溝腸桿菌作為條件致病菌，已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，可引起呼吸道、傷口、泌尿系統(tǒng)的感染和腦膜炎等疾病。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類(lèi)藥物的腸桿菌科細(xì)菌(CRE)不斷增加，給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。CRE主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯類(lèi)水解酶[1]。與此同時(shí)，Ⅰ類(lèi)整合子和插入序列如共同區(qū)1(ISCR1)在耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中起著重要的載體作用[2-3]。本研究主要調(diào)查佛山市第一人民醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“本院”)分離陰溝腸桿菌的臨床分布、耐藥率、碳青霉烯酶表型及其耐藥基因產(chǎn)生情況，為醫(yī)院感染的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 選擇2015年1月至2017年12月本院檢驗(yàn)科微生物室分離的16株陰溝腸桿菌為研究對(duì)象。標(biāo)本來(lái)源：痰液12例，尿液2例，血液2例，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株。

1.2儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀器(德國(guó)Eppendorf公司)；凝膠儀(Bio-Rad公司)；TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。利用法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK2-Compact儀器及其配套GN進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)。采用AST-GN13卡進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，采用K-B法進(jìn)行補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)，藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。根據(jù)2015年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，入選標(biāo)準(zhǔn)為亞胺培南耐藥的陰溝腸桿菌，即最低抑菌濃度(MIC)≥4 μg/L或K-B法折點(diǎn)≤19 mm；質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3方法

1.3.1改良Hodge試驗(yàn)表型篩查 依據(jù)CLSI M100-S23進(jìn)行改良Hodge試驗(yàn)。在生理鹽水中配制0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的大腸埃希菌ATCC25922，用生理鹽水1∶10稀釋并涂布至M-H 平板，在平板中央貼上10 μg厄他培南藥敏紙片，從藥敏紙片邊緣向平板邊緣劃待測(cè)菌，35 ℃孵育過(guò)夜，在被測(cè)菌株劃線與大腸埃希菌抑菌環(huán)交叉處細(xì)菌有增強(qiáng)生長(zhǎng)的趨勢(shì)為陽(yáng)性，即產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.3.2乙二胺四乙酸(EDTA)協(xié)同試驗(yàn) 配制0.1 mol/L EDTA-Na2，加10 μL至美羅培南(MEM)紙片上，無(wú)菌條件下自然干燥備用。配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海鶆蛲坎加贛H瓊脂平板，將MEM和MEM-EDTA-Na2的紙片貼于瓊脂表面。結(jié)果判斷：含酶抑制劑紙片與單藥紙片的抑菌圈直徑相差≥5 mm，提示該菌產(chǎn)生金屬 β-內(nèi)酰胺酶[4]。

1.3.3PCR擴(kuò)增 細(xì)菌的DNA提取參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，-20 ℃保存。相關(guān)基因的PCR反應(yīng)體系均為20 μL，其中含Mg2+的10×buffer 2 μL，dNTP 200 μmol/L，上下游引物0.2 μmol/L，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，加入滅菌去離子水至20 μL。blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48等碳青霉烯酶陽(yáng)性菌株由廣州醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院微生物室提供，具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)的引物序列

1.3.4PCR產(chǎn)物序列分析 得到的PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠，電壓為120 V，電泳時(shí)間40 min，最后經(jīng)溴化乙錠染色20 min后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，陽(yáng)性產(chǎn)物送華大基因科技公司進(jìn)行純化并雙向測(cè)序，利用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列校正，得到的序列與GenBank中序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行對(duì)比分析，確定基因亞型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Microsoft Excel2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn) 16株陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物，第三代、第四代頭孢菌素均耐藥，對(duì)氨曲南、阿米卡星、左氧氟沙星耐藥率分別為93.8%、31.2%、56.3%。見(jiàn)表2。

2.2碳青霉烯酶表型檢測(cè) 16株陰溝腸桿菌改良Hodge試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)均陽(yáng)性，分別提示16株菌株產(chǎn)碳青霉烯酶和產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。

2.3PCR分析 14株攜帶blaNDM-1基因，2株攜帶blaIMP-4基因，其余3種碳青霉烯酶基因均未檢出。16株ISCR1、Ⅰ類(lèi)整合酶和Ⅰ類(lèi)整合子基因盒均陽(yáng)性，見(jiàn)表3。

表2 16株陰溝腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：CRO為頭孢曲松；CAZ為頭孢他啶；FEP為頭孢吡肟；ATM為氨曲南；IMP為亞胺培南；MEM為美羅培南；AK為阿米卡星；LEV為左氧氟沙星；S為敏感；R為耐藥。

表3 16株陰溝腸桿菌相關(guān)耐藥基因分布

注：+為陽(yáng)性；-為陰性。

3 討 論

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是治療革蘭陰性桿菌感染，特別是腸桿菌科細(xì)菌感染效果最好的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，一旦碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥，臨床治療此類(lèi)菌株感染將面臨極大困難。本研究顯示，耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物有一定敏感性。由于氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物具有較強(qiáng)的腎毒性和耳毒性，使用該藥時(shí)應(yīng)慎重。在臨床治療此類(lèi)感染時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇中介或者敏感的抗菌藥物聯(lián)合用藥，如多黏菌素B或替加環(huán)素聯(lián)合碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物。陰溝腸桿菌耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，多種耐藥機(jī)制可協(xié)同作用，造成陰溝腸桿菌出現(xiàn)耐藥水平高及多重耐藥的現(xiàn)象。目前陰溝腸桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶以A類(lèi)KPC-2為主，B類(lèi)和D類(lèi)少見(jiàn)。但本院的耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌均產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，78.5%(14/16)為攜帶blaNDM-1基因，攜帶blaIMP-4基因僅發(fā)現(xiàn)2株。差異存在的原因可能與各地區(qū)間抗菌藥物使用情況以及地區(qū)環(huán)境不同所致。趙岐?jiǎng)偟萚10]對(duì)64株耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)29株攜帶IMP-4基因，35株攜帶IMP-8基因，未檢出VIM、OXA-48、NDM基因。在我國(guó)，NDM-1基因在鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率較高，在腸桿菌科細(xì)菌中報(bào)道病例較少，由于該基因常位于接合型質(zhì)粒上，在不同菌株之間易發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。LIU等[11]對(duì)11株耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌進(jìn)行研究，其中8株NMD-1陽(yáng)性，僅2株IMP-4陽(yáng)性。8株NDM-1基因上游均含有轉(zhuǎn)座元件ISAba125，可能來(lái)源于鮑曼不動(dòng)桿菌。近年來(lái)，有關(guān)腸桿菌科細(xì)菌攜帶blaIMP-4的報(bào)道逐漸增加，HU等[12]對(duì)中國(guó)5所教學(xué)醫(yī)院分離到的51株CRE進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP-4陽(yáng)性率分別為54.7%、17.6%、11.8%?？梢?jiàn)，我國(guó)不同地區(qū)CRE攜帶的碳青霉烯酶基因有所差異。但SIDJABAT等[13]發(fā)現(xiàn)，29株耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌均攜帶blaIMP-4基因；同時(shí)，DU等[14]在1例長(zhǎng)期住院患者中先后分離出耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌和大腸埃希菌，且HI2質(zhì)粒攜帶的blaIMP-4基因在兩者之間傳播。

改良Hodge試驗(yàn)是CLSI推薦的碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法，本研究通過(guò)改良Hodge試驗(yàn)進(jìn)行了菌株的表型檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，并以EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)金屬酶，通過(guò)PCR檢測(cè)證實(shí)菌株的產(chǎn)酶類(lèi)型為屬于Ambler 分類(lèi)中的產(chǎn)碳青霉烯酶和產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，但可能存在其他耐藥機(jī)制如細(xì)菌外膜蛋白、AmpC 酶缺失或菌株攜帶且高表達(dá)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)等，需進(jìn)一步通過(guò)基因擴(kuò)增或耐藥菌基因組測(cè)序來(lái)探討，這亦為本課題組下一步工作。

Ⅰ類(lèi)整合子、ISCR1為可移動(dòng)的遺傳元件，在細(xì)菌耐藥的水平傳播中起著重要作用。Ⅰ類(lèi)整合子在整合酶的作用下，可以捕獲外來(lái)的耐藥基因，并在位于整合子上游的啟動(dòng)子的作用下得到表達(dá)，從而獲得積累多重耐藥性的屬性。ISCR1以滾環(huán)形式轉(zhuǎn)座臨近的耐藥基因，并提供啟動(dòng)子，常參與構(gòu)建復(fù)雜性Ⅰ類(lèi)整合子構(gòu)成。DU等[14]發(fā)現(xiàn)，攜帶blaNDM-1基因的陰溝腸桿菌Ⅰ類(lèi)整合子和ISCR1陽(yáng)性，基因盒類(lèi)型為dfrA12-aadA2。SIDJABAT等[13]發(fā)現(xiàn)，攜帶blaIMP-4基因的陰溝腸桿菌Ⅰ類(lèi)整合子和ISCR1也為陽(yáng)性，基因盒類(lèi)型為blaIMP-4-aacA4。本研究發(fā)現(xiàn)16株均檢測(cè)到Ⅰ類(lèi)整合子和ISCR1，這些都加劇了多重耐藥性細(xì)菌的播散。此外，16株細(xì)菌擴(kuò)增出基因盒內(nèi)兩種基因型組合分別為dfrA17-aadA5、dfrA15-aadA2。本研究下一步工作將放在耐藥菌接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和同源性分析，進(jìn)一步驗(yàn)證碳青霉烯酶耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移能力及是否存在克隆性傳播現(xiàn)象。

綜上所述，CRE的耐藥情況較為嚴(yán)重，本院耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌以攜帶blaNDM-1的碳青霉烯酶耐藥基因?yàn)橹?。臨床工作中，需要加強(qiáng)對(duì)耐碳青霉烯類(lèi)陰溝腸桿菌耐藥性的檢測(cè)，規(guī)范抗菌藥物的使用；同時(shí)，加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員對(duì)CRE等多重耐藥菌感染的預(yù)防和控制。