miR-218-5p在胃癌細胞和胃癌組織中表達的臨床意義及生物信息學(xué)分析*

杜正平，李海龍，劉春萍，王轉(zhuǎn)兄，張雪燕，顧 靜，徐 燕

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730030；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，甘肅蘭州 730030；3.甘肅省酒泉市第二人民醫(yī)院檢驗科，甘肅酒泉 735000；4.甘肅省衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，甘肅蘭州 730030；5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，甘肅蘭州730030；6.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報編輯部，甘肅蘭州 730030

微小RNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性小型非編碼RNA分子，其長度約為22個核苷酸，可通過直接誘導(dǎo)信使RNA(mRNA)降解或通過與靶mRNA 3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)中的互補位點堿基配對而在動物和植物中發(fā)揮重要的基因調(diào)節(jié)作用[1]。miRNA參與細胞的發(fā)育、分化、增殖、遷移和應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過程[2]，其在體內(nèi)的異常表達對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。

miR-218是由miR-218-1和miR-218-2基因編碼的內(nèi)含子miRNA，位于腫瘤抑制基因SLIT2和SLIT3的內(nèi)含子中[3]。ZARE等[4]發(fā)現(xiàn)，miR-218在胃癌中的表達呈現(xiàn)出缺失或者下調(diào)的狀態(tài)；通過調(diào)節(jié)Robo1表達水平，miR-218可抑制肺癌細胞的遷移和侵襲[5]；過表達miR-218可促進膽囊癌細胞的凋亡，恢復(fù)對吉西他濱的敏感性[6]。GUAN等[7]研究表明，miR-218在前列腺癌中低表達，過表達miR-218后可抑制腫瘤的遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和癌癥干細胞特性。AHMADINEJAD等[8]通過計算機基因本體論和信號通路富集分析，闡明miR-218在人乳腺癌中的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。雖有研究已闡明miR-218在胃癌細胞中的調(diào)控機制[9-10]，但對其在不同分化程度細胞中的表達以及其調(diào)控的靶基因和對預(yù)后的影響進行系統(tǒng)研究的報道較少。因此，本研究將通過檢測miR-218-5p在胃癌細胞和胃癌組織中的表達，分析其臨床意義，并采用生物信息學(xué)方法，以明確其表達和意義，為胃癌的進一步研究提供線索。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 胃癌細胞AGS、SGC-7901、MKN-45、MGC-803、BCG-823、HGC-27和正常胃黏膜上皮細胞GES-1購自中國科學(xué)院上海細胞庫、北京協(xié)和腫瘤研究所細胞庫和上海和元生物公司。

1.1.2組織標(biāo)本 選取2009年10月至2010年4月甘肅省武威腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的37例胃癌患者作為研究對象，其中男21例，女16例；年齡35～76歲，中位年齡56歲。取胃癌及其周圍組織標(biāo)本(距離癌灶5 cm以上，且經(jīng)HE染色證實均無癌細胞)進行研究，其中癌組織標(biāo)本37例，癌旁組織標(biāo)本37例。取材后，立即放入液氮中并轉(zhuǎn)入-80 ℃長期保存。以上患者均有完整的臨床資料，包括姓名、性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。所有患者術(shù)前均未接受過放、化療。

1.2儀器與試劑 高糖DMED培養(yǎng)基(GE Healthcare Life sciences公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，RNA裂解液RNAiso Plus(Takara Bio公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit，廣州復(fù)能基因公司)，內(nèi)參照U6特異引物(美國GeneCopoeiaTM公司，序列編號HmiRQP9001)，通用引物(Takara Bio公司，編號D350A)，miR-218特異引物(美國GeneCopoeiaTM公司，序列編號HmiRQP0327)，超微量分光光度計(P100+，Putton公司)，實時定量PCR儀(LightCycler 9600，羅氏公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，補充10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，并在37 ℃、5%CO2中溫育。細胞換液間隔時間為2～3 d，當(dāng)細胞覆蓋率達到培養(yǎng)皿底部的70%～80%時進行胰酶消化后傳代。

1.3.2實時熒光定量PCR 根據(jù)制造商的說明，用Trizol試劑從培養(yǎng)的細胞和組織中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄過程在37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min這一條件下完成，將吸光度(A260/280)為1.8～2.2的標(biāo)本置于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)試驗。PCR循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 10 s，變性95 ℃ 10 s，退火60℃ 20 s，共40個循環(huán)。完成擴增后進行熔解曲線分析，內(nèi)參基因為U6，采用2-ΔΔCt法計算各組間miRNA水平的表達差異，試驗重復(fù)3次。

1.3.3miR-218-5p的靶基因和靶基因富集信號通路分析 運用miRecords網(wǎng)站(http://c1.accurascience.com/miRecords/index.php)中的生物信息學(xué)軟件對miR-218-5p潛在的靶基因進行預(yù)測，取其交集，使用DAVID6.7數(shù)據(jù)庫對所獲得的靶基因進行KEGG Pathway通路富集分析。

1.3.4miR-218-5p胃癌組織的表達和生存期分析 基于OncomiR數(shù)據(jù)庫，分析miR-218-5p在胃癌細胞和正常胃黏膜上皮細胞中的表達，并利用cBioportal網(wǎng)站對其進行預(yù)后分析。

2 結(jié) 果

2.1胃癌細胞與正常胃黏膜上皮細胞中miR-218-5p水平的比較 正常胃黏膜上皮細胞GES-1中miR-218-5p水平為1.00±0.03，miR-218-5p在不同分化程度的胃癌細胞MKN-45、SGC-7901、MGC-803、BCG-823、HGC-27、AGS表達水平分別為0.15±0.04、0.34±0.03、0.26±0.06、0.10±0.01、0.23±0.05、0.03±0.02，低于正常胃黏膜上皮細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=30.611、27.344、18.963、52.713、21.878、46.982，P<0.01)。

2.2胃癌組織和癌旁組織中miR-218-5p的表達 與癌旁組織比較，有2例患者胃癌組織中miR-218-5p表達上調(diào)，35例表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。進一步進行臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在胃癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)和TNM分期(P<0.001)有關(guān)，而與年齡、性別、癌細胞分化程度、淋巴管轉(zhuǎn)移、靜脈轉(zhuǎn)移、Borrmann分型、浸潤深度無關(guān)，見表1。

圖1 miR-218-5p在胃癌組織相對于癌旁組織中的表達情況

表1 miR-218 -5p在胃癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[M(P25,P75)]

續(xù)表1 miR-218 -5p在胃癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[M(P25,P75)]

2.3miR-218-5p的靶基因預(yù)測和靶基因富集的生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析結(jié)果可見，miR-218-5p的預(yù)測靶基因富集在60個信號通路中，其中與腫瘤密切相關(guān)的有30個，涉及多種腫瘤凋亡、細胞周期、增殖、代謝、侵襲轉(zhuǎn)移以及多個關(guān)鍵的信號通路，見表2。

表2 miR-218-5p預(yù)測靶基因富集信號通路分析

續(xù)表2 miR-218-5p預(yù)測靶基因富集信號通路分析

2.4基于OncomiR數(shù)據(jù)庫對miR-218-5p在胃癌中的表達及預(yù)后的生存分析 經(jīng)OncomiR數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomir.org)檢索發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在胃癌組織中的表達顯著低于癌旁組織中的表達(P=3.10×10-3)，見圖2。為分析miR-218-5p在胃癌中的表達與預(yù)后之間的關(guān)系，本研究使用此數(shù)據(jù)庫進一步分析了miR-218-5p在胃癌中的表達與生存期的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p低表達患者其生存期顯著短于表達正?；颊?P=0.016 32)，見圖2。使用cBioportal(http://cbioportal.org)工具并對其進行Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示，黏液腺癌(n=72)、乳頭狀腺癌(n=22)和彌漫型腺癌(n=8)患者中，低表達組的總生存期(OS)短于對照組(P=0.048)，見圖3。

圖2 利用OncomiR數(shù)據(jù)庫分析miR-218-5p在胃癌中的表達與預(yù)后的關(guān)系

圖3 利用cBioportal工具分析miR-218-5p表達與預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

近年來，通過研究miRNA在癌癥中的表達及作用，越來越多的人對基因調(diào)控有了全新的認知[11]。miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，是一種重要的調(diào)節(jié)因子[12]。大量研究表明，不同類型癌癥中異常表達的miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物過程發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤患者預(yù)后分析的生物標(biāo)志物[13-16]。

miR-218可以作為腫瘤抑制因子，在體內(nèi)表達下調(diào)。多項報道指出，miR-218可抑制食管癌[17]、宮頸癌[18]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[19]、膀胱癌[20]、卵巢癌[21]和胃癌[22]等癌細胞的增殖、侵襲、遷移、上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和自我更新。此外，miR-218在一些造血系統(tǒng)疾病，如急性早幼粒細胞白血病(APL)中也表達下調(diào)，且其差異表達與APL的臨床特征密切相關(guān)[23]。成熟的miR-218被剪切成miR-218-5p和miR-218-3p，miR-218-3p有兩個亞型，分別為miR-218-1-3p和miR-218-2-3p。在本研究中，miR-218-5p在不同分化程度胃癌細胞中的表達明顯低于正常胃黏膜GES-1細胞，此外，PCR顯示，miR-218-5p在胃癌組織中的表達水平明顯低于胃癌旁組織，這與較多報道結(jié)果一致[24-26]，也與OncomiR數(shù)據(jù)庫miR-218-5p的表達結(jié)果一致。臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在胃癌中的低表達，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.001)，而與年齡、性別、分化程度、靜脈轉(zhuǎn)移及Borrmann分型無相關(guān)性(P>0.05)。有研究表明，甘肅省武威地區(qū)為胃癌高發(fā)地區(qū)[27]，且本研究標(biāo)本來源于武威地區(qū)的患者，代表性強。部分研究表明，miR-218-5p通過靶向調(diào)控ROBO1、LASP1、WASF3、血管生成素-2等調(diào)節(jié)胃癌細胞的增殖、分化以及凋亡[28-30]。然而，還有更多的靶基因尚未得到驗證，因此，本研究通過在miRecords網(wǎng)站上預(yù)測其靶基因并進行信號通路富集分析，結(jié)果顯示，60個信號通路中，與腫瘤相關(guān)的信號通路有30個，包括PI3K-Akt、ErbB、Wnt、mTOR等涉及多種腫瘤細胞凋亡、增殖、代謝、侵襲、轉(zhuǎn)移以及多個關(guān)鍵的信號通路。此外，為分析miR-218-5p和miR-218-3p兩個亞型在胃癌中的表達與其預(yù)后之間的關(guān)系，本研究使用了OncomiR數(shù)據(jù)庫和cBioportal工具對其進行預(yù)后分析，結(jié)果顯示miR-218-5p在胃癌中的表達與胃癌患者OS具有顯著相關(guān)性，miR-218-5p低表達患者其生存期時間顯著短于表達正常患者(P=0.016 32)。且在黏液腺癌、乳頭狀腺癌和彌漫型腺癌患者中，低表達組的OS短于對照組(P=0.048)。本研究結(jié)果為miR-218-5p的功能研究提供了新的思路，該標(biāo)志物可能成為胃癌新的治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物。