清燥救肺湯對(duì)荷Lewis小鼠肺癌細(xì)胞中ACO1與ACL和FFA及CHO的影響＊

胡 橋，余 功，饒 斌，謝 斌

（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

肺癌常有干咳少痰、痰中帶血、聲音嘶啞等燥熱傷肺表現(xiàn)，西醫(yī)放化療雖能明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖，但其燥熱癥狀仍然存在，嚴(yán)重影響肺癌患者的生活質(zhì)量[1]。因此，抑制肺癌細(xì)胞增殖同時(shí)緩解燥熱是臨床治療肺癌急需解決的問題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺為嬌臟，喜潤(rùn)惡燥，易受外界燥邪入侵致病，燥熱傷肺是肺癌的重要病機(jī)[2]。清燥救肺湯甘涼滋潤(rùn)，清金保肺，實(shí)為清熱潤(rùn)燥良方，凡病機(jī)屬燥熱傷肺、氣陰兩傷，臨床表現(xiàn)為一派津虧燥熱癥狀，均可遵照“燥者濡之”的原則應(yīng)用本方加減進(jìn)行治療。故清燥救肺湯常用于肺癌臨床應(yīng)用，療效顯著，為諸多醫(yī)家所推崇[3-6]。

腫瘤細(xì)胞的增殖需要大量能量及合成原料，因此抑制細(xì)胞的能量生成，減少中間代謝產(chǎn)物合成，可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。順烏頭酸酶（ACO1）及三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶(ACL)是三羧酸循環(huán)的兩個(gè)關(guān)鍵酶，抑制其表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞能量代謝速率，減少游離脂肪酸（FFA）及膽固醇（CHO）腫瘤細(xì)胞合成原材料，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[7-8]。

本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)清燥救肺湯能顯著抑制荷Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵限速酶活性，降低葡萄糖的攝取率，減少乳酸形成，從而導(dǎo)致進(jìn)入三羧酸途徑的乳酸明顯減少。故本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擬建立荷Lewis 肺癌小鼠模型，從三羧酸循環(huán)能量代謝角度進(jìn)一步探索清燥救肺湯抗肺癌的機(jī)制，以期為臨床提供參考。

1 材料

1.1 藥物

清燥救肺湯組成：生石膏12 g，阿膠9 g，霜桑葉9 g，枇杷葉9 g，炙甘草3 g，麥冬10 g，黨參12 g，苦杏仁9 g，于北京同仁堂藥店購(gòu)買。將中藥放入10 倍清水中浸泡0.5 h 后煎煮1 h，藥液沸騰后再改用文火繼續(xù)煎煮40 min，然后用三層紗布進(jìn)行過濾，確保過濾干凈；留下的藥渣繼續(xù)加入8 倍量的清水進(jìn)行第二次煎煮，同理煮沸后改用文火煎煮40 min，繼續(xù)用三層紗布過濾，將兩次濾液混合在一起，置于60℃恒溫烘箱內(nèi)烘干后用打粉機(jī)研磨成干粉27.62 g（1 g 含0.28 g 雜質(zhì)），故干粉實(shí)際有效成分質(zhì)量為27.62×0.72=19.9 g，得率19.9 g/73 g=27.26%。密封干粉，4 ℃保存?zhèn)溆?。藥量?jì)算方法參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[9]，小鼠用藥劑量=標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量×人的劑量，將小鼠中劑量代替人臨床劑量。經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究探索，本研究將清燥救肺湯高、中、低劑量分別定為11，5.5，2.75 g·kg-1·d-1。陽性藥物采用環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字16092525）進(jìn)行腹腔注射，每次給藥劑量 25 mg·kg-1·d-1，隔日進(jìn)行1次。

1.2 動(dòng)物和瘤株

黑色雄性小鼠(SPF 級(jí)C57BL/6J) 50 只，單只質(zhì)量（20±2）g，于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司購(gòu)入，合格證號(hào)NO.201709571。小鼠Lewis 原代肺癌細(xì)胞（編號(hào)36470TM），從ATCC 細(xì)胞庫購(gòu)入，批號(hào)JZLLSC:2017-0030。

1.3 試劑

RIPA 細(xì)胞裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)C1053）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)151-21-3）；BCA 蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)CW0014S)；封閉專用脫脂奶粉（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)P1622）；PCR mix(美國(guó)MCE 公司，批號(hào)HY-K0501)；CHO、FFA 酶鏈免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)分別為JL18914，JL11286）。

1.4 儀器

CO2-IR 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海丙林電子科技有限公司），Neofuge 13R型高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司），TC-100B 型恒溫?fù)u床（上海領(lǐng)成生物科技有限公司），92-14860-00 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) Alpha Innotech 公司），XW-80A 型 LongGeneRNA 逆轉(zhuǎn)錄儀（上海青浦滬西儀器廠），AFD9600 型熒光定量PCR儀（杭州安杰思有限公司）。

2 方法

2.1 Lewis細(xì)胞的培養(yǎng)及造模方法

將Lewis 細(xì)胞從液氮罐中拿出快速?gòu)?fù)蘇，然后在培養(yǎng)瓶中加入3 ml 10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放于含5% CO237 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好Lewis 細(xì)胞用生理鹽水將其密度調(diào) 至 5×106個(gè)/mL，再 以 0.2 mL/只 接 種 于 小 鼠 右腋下[10]。

2.2 分組及給藥

將小鼠隨機(jī)分為5 個(gè)小組，每組10 只，5 個(gè)小組分別是模型組，CTX 組，清燥救肺湯高、中、低劑量組。以接種后開始計(jì)算，24 h后，模型組用生理鹽水進(jìn)行灌胃，0.2 mL/只，每 12 h 給藥 1 次；CTX 組用環(huán)磷酰胺進(jìn)行腹腔注射，按50 mg·kg-1劑量給藥，隔日一次；清燥救肺湯高、中、低劑量組則在造模前2周即開始進(jìn)行灌胃給藥，高、中、低劑量分別按照11，5.5，2.75 g·kg-1·d-1給藥，每12 h給藥1次，接種后繼續(xù)給藥2周。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACL mRNA表達(dá)水平

取冰凍腫瘤組織50 mg 于研缽中，往研缽里倒入適量的液氮用研錘進(jìn)行充分研磨，然后往研缽中加入trizol 1 mL，靜置 5 min 后于 4 ℃，12 000 r·min-1離心 10 min，離心后取出靜置5 min，加入氯仿0.2 mL，劇烈震蕩30 s，靜置3 min，以4 ℃，12 000 r·min-1 第二次離心10 min；吸取上層水相至另一離心管中加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后以 4 ℃，12 000 r·min-1離心 10 min，棄上清，留沉淀；75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌；再以4 ℃，12 000 r·min-1離心 2 min，棄上清，留 RNA 沉淀；放置2～3 min，晾干后加入無酶水30～100 μL 溶解，充分溶解提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因?yàn)閮?nèi)參，采用兩步法PCR 反應(yīng)程序，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s；61 ℃退火10 s；72 ℃延伸1 min；共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄相應(yīng)Ct值和溶解曲線，所有樣品均重復(fù)檢3 次。以2-△△Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物通過引物設(shè)計(jì)軟件oligo6 自行設(shè)計(jì)，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)ACO1 蛋白表達(dá)

取腫瘤組織0.1 g，充分剪碎放入EP 管中加入鋼珠和RIPA 裂解液，將EP 管放入組織勻漿機(jī)中充分裂解 30 min；4℃，12 000 r·min-1離心 15 min，提取其總蛋白上清液，用BCA 法按說明書測(cè)定蛋白濃度。以GAPDH 為上樣內(nèi)參對(duì)照。將各組蛋白調(diào)至等濃度后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，TBST 洗膜3 次，加入一抗（1：6 000），4℃孵育過夜；洗膜，加二抗（1：6 000），顯影，曝光。采用Alpha view SA 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.5 ELISA檢測(cè)FFA、CHO的含量

取腫瘤組織上清液，按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作。然后將反應(yīng)好的96 孔板放入酶標(biāo)儀中以450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔的A，最后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔A繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算各樣品濃度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 清燥救肺湯對(duì)荷Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞ACO1 蛋白含量及ACL mRNA表達(dá)的影響

圖1 荷Lewis小鼠肺癌組織ACO1蛋白表達(dá)電泳

與模型組比較，CTX 組及清燥救肺湯高、中、低劑量組ACO1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與CTX組比較，清燥救肺湯高、中、低劑量組ACO1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組相比，中、低劑量組 ACO1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與清燥救肺湯中劑量組相比，低劑量組ACO1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，CTX 組及清燥救肺湯高、中、低劑量組肺癌細(xì)胞中ACL mRNA 表達(dá)降低(P＜0.01)；與CTX 組相比，清燥救肺湯高、中、低劑量組中ACL mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組相比，清燥救肺湯中、低劑量組ACL mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與中劑量組相比，低劑量組中 ACL mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），見表 2及圖1。

3.2 清燥救肺湯對(duì)荷Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞CHO 濃度及FFA濃度的影響

與模型組比較，CTX 組及清燥救肺湯高、中、低劑量組CHO 濃度降低（P＜0.01）；與CTX 組相比，清燥救肺湯高、中、低劑量組中CHO 濃度升高（P＜0.05，P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組比較，中、低劑量組CHO 濃度升高（P＜0.05，P＜0.01）；與中劑量組比較，低劑量組CHO 濃度升高（P＜0.05）。與模型組比較，清燥救肺湯高、中、低劑量組及化療組FFA 濃度降低（P＜0.01）；與CTX 組相比，清燥救肺湯高、中、低劑量組中FFA 濃度升高（P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組比較，中、低劑量組FFA 濃度升高（P＜0.01）；與中劑量組比較，低劑量組FFA 濃度升高（P＜0.01），見表3。

表2 清燥救肺湯對(duì)荷Lewis小鼠肺癌細(xì)胞ACL mRNA表達(dá)及ACO1蛋白的影響(,n=5)

表2 清燥救肺湯對(duì)荷Lewis小鼠肺癌細(xì)胞ACL mRNA表達(dá)及ACO1蛋白的影響(,n=5)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CTX組比較##P＜0.01；與高劑量組比較●P＜0.05，●●P＜0.01；與中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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表3 清燥救肺湯對(duì)荷Lewis小鼠肺癌細(xì)胞CHO濃度及FFA濃度的影響(,n=5)

表3 清燥救肺湯對(duì)荷Lewis小鼠肺癌細(xì)胞CHO濃度及FFA濃度的影響(,n=5)

注：化療組為隔日給藥；與模型組比較，**P＜0.01；與CTX 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與高劑量組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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4 討論

腫瘤細(xì)胞不同于正常細(xì)胞，其以更頻繁的分裂增殖為特征，其代謝必然會(huì)發(fā)生重大改變。三羧酸循環(huán)作為人體糖、脂、蛋白質(zhì)代謝的關(guān)鍵途徑和最終通路，該循環(huán)過程中產(chǎn)生檸檬酸、游離脂肪酸、膽固醇等多種中間代謝產(chǎn)物，進(jìn)而為腫瘤細(xì)胞快速增殖提供了大量的原材料[11]。亦有研究[12-13]表明，三羧酸循環(huán)的新陳代謝重新編排是腫瘤細(xì)胞的重要特點(diǎn)，該循環(huán)中的關(guān)鍵激酶如ACL、ACO1 及其代謝產(chǎn)物參與了腫瘤的發(fā)生過程。

腫瘤細(xì)胞脂肪酸合成增強(qiáng)，導(dǎo)致三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）檸檬酸裂解酶的過量表達(dá)及活性升高[14]。ACL 作為脂肪酸合成的調(diào)控酶，可在胞質(zhì)中將檸檬酸分解為草酰乙酸和乙酰輔酶A，乙酰輔酶A 不僅是內(nèi)源性脂肪酸合成的主要原料，亦是合成膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。因此ACL 是脂質(zhì)代謝與糖代謝(產(chǎn)能)之間的橋梁，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ACL 在肺癌、胃癌及肝癌等多種腫瘤疾病中表達(dá)升高或活化增強(qiáng)[15]。小干擾RNA 或應(yīng)用藥物抑制ACL，能減緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，PCR 結(jié)果顯示清燥救肺湯高、中、低劑量組ACL mRNA 表達(dá)均低于模型組，提示清燥救肺湯可能通過抑制ACL mRNA 酶，減少三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞合成。

三羧酸循環(huán)通過底物水平磷酸化有效地催化乙酰 輔 酶 A 成 為 CO2，并 同 時(shí) 產(chǎn) 生 NADP，NADH2 和ATP。NADP，NADH2 通過氧化磷酸化最終產(chǎn)生ATP，ACO1 又稱烏頭酸水合酶或檸檬酸(異檸檬酸)裂解酶，是三羧酸循環(huán)途徑中不可缺少的關(guān)鍵酶，也是NO 和H2O2等活性氧作用的主要靶點(diǎn)[16]，能催化檸檬酸經(jīng)順烏頭酸最終生成異檸檬酸。研究[17]顯示，抑制順烏頭酸酶會(huì)影響三羧酸循環(huán)效率，同時(shí)還能引起線粒體膜電位下降，氧化磷酸化效率的降低，最終造成線粒體的能量合成下降。本實(shí)驗(yàn)中Western blot結(jié)果顯示，清燥救肺湯高、中、低劑量組肺癌細(xì)胞ACO1蛋白表達(dá)量均低于模型組，表明清燥救肺湯抑制肺癌細(xì)胞能量生成，ACO1可能是其效應(yīng)靶點(diǎn)之一。

脂肪酸是細(xì)胞構(gòu)建膜磷脂的基本原料，腫瘤細(xì)胞具有不斷增殖的特征，其增殖需大量脂肪酸[18]。因此，脂肪酸的合成增強(qiáng)，是腫瘤細(xì)胞代謝改變的另一重要特征。腫瘤細(xì)胞可利用從頭合成途徑產(chǎn)生脂肪酸從而維持自身的增殖與存活[19-20]，通過化學(xué)抑制或敲減其生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因可有效減少腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)[21]。此外，脂肪酸合成通路的活化也與腫瘤患者無病生存期縮短及預(yù)后不良密切相關(guān)。流行病學(xué)研究[22]顯示，在肺癌、結(jié)腸癌、腎癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中，F(xiàn)FA 表達(dá)及活性增加，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分，脂質(zhì)雙分子中脂筏結(jié)構(gòu)是其關(guān)鍵組成部分。惡性腫瘤細(xì)胞增殖時(shí)，膽固醇攝取增多、合成加速。Sok 等[23]研究表明膽固醇水平＜5.3 mmol/L 的患者總生存率顯著低于高膽固醇組患者，提示非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)前總膽固醇水平與術(shù)后預(yù)后有關(guān)。亦有研究[24]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上的膽固醇增加能誘導(dǎo)脂筏聚集，吸引表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）及Ras 等蛋白到脂筏中，這些蛋白受刺激后被激活，通過信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中ELISA 結(jié)果提示，清燥救肺湯高、中、低劑量組肺癌細(xì)胞中膽固醇及脂肪酸表達(dá)量低于模型組，表明清燥救肺湯能抑制肺癌細(xì)胞增殖可能是通過減少腫瘤細(xì)胞合成原材料，抑制其脂質(zhì)合成。

中醫(yī)藥在肺癌綜合治療模式中占有越來越重要的地位，其在促進(jìn)患者術(shù)后恢復(fù)，減輕放化療副作用、有效延長(zhǎng)患者生存期方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。清燥救肺湯主治燥熱傷肺，氣陰兩傷證，與肺癌燥熱病證十分相符，實(shí)驗(yàn)與臨床研究均證實(shí)清燥救肺湯具有良好的抗肺癌效果。本研究結(jié)果表明，清燥救肺湯能有效抑制荷Lewis 肺癌細(xì)胞能量代謝，減少相關(guān)代謝產(chǎn)物生成，其機(jī)制可能與下調(diào)ACL mRAN 及ACO1的表達(dá)，并降低癌細(xì)胞中FFA、CHO 含量有關(guān)，但該方對(duì)上述調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入的研究。