基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制＊

劉博男，宋 輝，薛 屹，孫向明，胡 揚，李文蘭＊＊

（1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心 哈爾濱 150076）

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是一種以骨密度及骨量下降、骨組織的微結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度損害，造成患者骨脆性增加，易于發(fā)生骨折為特征的疾病，病癥以老年人和絕經(jīng)后婦女為主要發(fā)病人群，主要表現(xiàn)有駝背、腰背疼痛、骨折乃至呼吸功能下降[1]。近年來，伴隨我國老齡化加劇，老齡人口數(shù)目增加，該病癥備受關(guān)注。且由于女性絕經(jīng)后卵巢功能下降，體內(nèi)雌激素水平顯著下降，絕經(jīng)時間和體質(zhì)量指數(shù)是影響骨質(zhì)疏松癥的最重要的相關(guān)因素，因此絕經(jīng)后婦女易發(fā)生骨質(zhì)疏松[2]。目前，雌激素受體α（ERα）仍是預(yù)防絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的首選靶標(biāo)[3-4]。因此，充分認(rèn)識骨質(zhì)疏松，了解其發(fā)病機(jī)制，做到有效預(yù)防、及時準(zhǔn)確治療，對緩解骨質(zhì)疏松意義重大。

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子（CuscutaaustralisR. Br.）或菟絲子（Cuscuta chinensisLam.)的干燥成熟種子。近年藥理研究[5]發(fā)現(xiàn)菟絲子對生殖系統(tǒng)、骨代謝、免疫系統(tǒng)等多方面均有良好的藥理活性，且其具有清除自由基和抗氧化的作用。據(jù)文獻(xiàn)[6-8]報道，菟絲子在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的臨床應(yīng)用方面均有明顯療效。臨床上菟絲子也是常見的用于防治骨質(zhì)疏松的中藥，在眾多防治骨質(zhì)疏松的復(fù)方中均有菟絲子的應(yīng)用，右歸丸中菟絲子在養(yǎng)肝的同時兼顧補(bǔ)腎，對降低原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者骨折發(fā)生率有顯著療效[9]；聯(lián)合鈣片使用后血清中骨鈣蛋白（BGP）的活性增高，且25-OHD3、IGF-I 水平得以改善[10]，因此闡明菟絲子治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制也可為今后合理用藥、聯(lián)合用藥提供參考依據(jù)。

中藥研究的重點和難點之一是理解中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證生物系統(tǒng)間的作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以多向系統(tǒng)藥理學(xué)與生物學(xué)為基礎(chǔ)提出來一種的藥物研究新方法，通過建立網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)將病證、藥物映射于生物分子網(wǎng)絡(luò)，然后通過軟件及專業(yè)數(shù)據(jù)庫對病證與藥物的關(guān)系進(jìn)行計算、分析與預(yù)測，以期發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制[11-12]。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過篩選中藥成分，預(yù)測有效成分發(fā)揮作用的靶蛋白，分析靶蛋白涉及的信號通路來探討中藥治療疾病的機(jī)制[13]。本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測菟絲子參與治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制，對菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的有效成分及對應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行歸納整理，總結(jié)出菟絲子“活性成分-靶標(biāo)-通路”三者之間的聯(lián)系，為探索菟絲子可能的預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分的獲取與活性成分的篩選

從 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫中以“菟絲子”或“cuscuta”為關(guān)鍵詞，搜索有關(guān)菟絲子所含所有化學(xué)成分的信息[14]，并綜合篩選活性成分，網(wǎng)址詳見表1。同時根據(jù)文獻(xiàn)報道對篩選后的成分進(jìn)行補(bǔ)充，通過查閱文獻(xiàn)得到菟絲子與治療骨質(zhì)疏松高度相關(guān)的化合物，對篩選后的成分進(jìn)行補(bǔ)充，最終確定菟絲子發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分。

1.2 菟絲子活性成分作用靶標(biāo)及骨質(zhì)疏松癥靶標(biāo)的獲取

使用 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫復(fù)制并下載化合物靶標(biāo)信息，獲得中藥菟絲子活性成分的靶蛋白，篩選有效成分靶標(biāo)。利用GeneCards、OMIM[15]數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞 Osteoporosis，篩選并導(dǎo)出疾病相關(guān)靶標(biāo)[16]，整理在數(shù)據(jù)庫中收集的與骨質(zhì)疏松相關(guān)的靶標(biāo)，刪除重復(fù)靶標(biāo)并篩選出菟絲子活性成分與骨質(zhì)疏松的共同靶標(biāo)，為后期構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治鲎鰷?zhǔn)備。

表1 數(shù)據(jù)庫及分析平臺

1.3 “活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“1.1”項得到的菟絲子的活性成分和“1.2”項收集的菟絲子活性成分相對應(yīng)的治療骨質(zhì)疏松癥的靶標(biāo)導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.6.0，構(gòu)建菟絲子的“活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中“節(jié)點”（node）表示中藥所含活性成分及作用靶標(biāo)，“邊”（edge）表示活性成分與靶標(biāo)間的關(guān)系。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

基因或蛋白并不是孤立地發(fā)揮作用，通常情況下是與多個基因或蛋白相互影響，這種基因或蛋白之間相互作用構(gòu)成了PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用String 數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用[17]。將“1.2”項菟絲子的蛋白靶標(biāo)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”即人類，設(shè)置隱藏游離靶標(biāo)，設(shè)定蛋白相互作用分值為0.4，獲取相應(yīng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的關(guān)系。

1.5 菟絲子作用于骨質(zhì)疏松癥的GO 富集分析和KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫，輸入“1.2”項中得到靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，靶基因名修正為“official gene symbol”，列出得到作用靶標(biāo)的GO 富集分析及KEGG 通路富集分析，篩選出與骨質(zhì)疏松疾病相關(guān)的生物過程及通路進(jìn)行深入分析。

2 結(jié)果

2.1 菟絲子活性成分分析

搜索 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫，收集到菟絲子的活性成分，參考藥代動力學(xué)ADME 參數(shù)，以口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選同時符合上述條件的活性成分，從數(shù)據(jù)庫中篩選出符合條件的活性成分11 個，包括芝麻素、異鼠李素、β-谷甾醇、苦參堿、槲皮素等，此外通過查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充得到菟絲子與治療骨質(zhì)疏松高度相關(guān)的化合物3 個：芹菜素、金絲桃苷、紫云英苷[18-21]。將這14個成分確定為菟絲子發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分（表2）。

表2 菟絲子主要活性成分基本信息

2.2 潛在靶標(biāo)預(yù)測

在 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 數(shù)據(jù)庫中檢索菟絲子活性成分的潛在靶標(biāo)，去除重復(fù)靶標(biāo)后，共得到126 個潛在靶標(biāo)，GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中找到與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶標(biāo)共3 126個。將活性成分對應(yīng)的潛在靶標(biāo)與GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中與骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標(biāo)的比較，篩選出菟絲子治療骨質(zhì)疏松的83個潛在作用靶標(biāo)（圖1）。

2.3 “活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖1 藥物-疾病靶標(biāo)Venn分析圖

將菟絲子活性成分和靶標(biāo)的相互作用關(guān)系等信息輸入Cytoscape 3.6.0 軟件中，構(gòu)建菟絲子“活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，由圖2 可知，活性成分-靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)中包含活性成分節(jié)點14 個，靶標(biāo)節(jié)點83 個，節(jié)點間相互作用關(guān)系的邊231條。

2.4 靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過String 數(shù)據(jù)庫獲取靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系，設(shè)置中選擇隱藏游離點，選擇相關(guān)作用分?jǐn)?shù)為0.4，下載TSV 格式，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件中構(gòu)建靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.6.0 繪制蛋白相互作用的圖形，由圖3可知，經(jīng)過篩選得到靶標(biāo)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點81 個，邊814 條。結(jié)合現(xiàn)有的研究結(jié)果，推測菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥可能與白細(xì)胞介素-6（IL-6）、胰島素（INS）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、骨分化特異性轉(zhuǎn)錄分子2（RUNX2）、雌激素受體α（ESR1）等靶標(biāo)有關(guān)。

2.5 菟絲子作用于骨質(zhì)疏松癥的GO 功能分析及KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫后，得到GO功能分析表明：83個藥物-疾病交集靶標(biāo)影響了82 個生物學(xué)過程（P＜0.05），選取最為顯著的20 個生物學(xué)過程繪制GO 功能分析圖，見圖4；菟絲子通過改變DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA 聚合酶II 特異性、輔因子結(jié)合、核受體活性等發(fā)揮藥效。KEGG 富集分析得到91 條通路(P＜0.05)，根據(jù)KEGG 富集分析及結(jié)合現(xiàn)有研究結(jié)果（圖5）：PI3K/Akt 信號通路（PI3K/Akt signaling pathway）；腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）；MAPK 信號通路；Wnt 信號通路；胰島素拮抗信號通路（Insulin resistance signaling pathway）等通路與菟絲子治療骨質(zhì)疏松的潛在靶標(biāo)密切相關(guān)，表明菟絲子可能通過多條通路作用于骨質(zhì)疏松發(fā)揮其藥效。

圖2 活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 菟絲子潛在靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO功能分析

圖5 KEGG富集分析圖

3 討論

3.1 菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥的意義

伴隨我國人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松患者人數(shù)逐年遞增。且該病常呈現(xiàn)漸進(jìn)性、隱蔽性，患病后致殘率、致死率均較高，因此是危害中老年人健康的重大疾病[22]。古人通過長期的中藥應(yīng)用實踐，總結(jié)出“腎主骨、生髓”的中醫(yī)理論，將補(bǔ)腎藥用于骨科疾病的治療；中醫(yī)理論認(rèn)為，腎為先天之本，骨骼的生長、發(fā)育及衰弱與腎精盛衰緊密相關(guān)，骨質(zhì)疏松癥在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中為腎虛導(dǎo)致，因此中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松以補(bǔ)腎為主[23-24]。菟絲子作為補(bǔ)益肝腎的中藥對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、改善卵巢早衰、保肝明目等方面有著顯著的藥理活性[25-26]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論基礎(chǔ)，借助有關(guān)數(shù)據(jù)庫及繪圖軟件等工具對中藥菟絲子治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

3.2 主要成分分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，菟絲子防治骨質(zhì)疏松的成分有：槲皮素、山奈酚、金絲桃苷、異鼠李素等14 種成分。研究[27]表明槲皮素可通過抑制細(xì)胞衰老進(jìn)而減少因雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨流失，成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一種方法。還可以通過促進(jìn)骨分化改善骨質(zhì)疏松癥[28]；山奈酚的作用機(jī)制可能與抑制骨吸收有關(guān)[29]；金絲桃苷可通過 BMP 和 Wnt/β-catenin 信號通路共同促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及分化[19]。異鼠李素防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制則是通過調(diào)控RANKL/RANK/OPG 信號通路，同時調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能，改善骨微結(jié)構(gòu)上的破壞，實現(xiàn)防治骨質(zhì)疏松癥[30]。由此可見菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分是通過不同作用機(jī)制生效。

3.3 主要靶標(biāo)分析

菟絲子和骨質(zhì)疏松的交集靶基因共83個，與疾病顯著相關(guān)的靶標(biāo)有IL-6、骨分化特異性轉(zhuǎn)錄分子2（Runx2）、VEGFA 等，經(jīng)過GO 功能分析出菟絲子治療骨質(zhì)疏松的生物學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA 聚合酶II 特異性、輔因子結(jié)合、核受體活性等。其中IL-6 可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性[31]。Runx2 作為成骨分化過程中一個必要的轉(zhuǎn)錄因子，適量的Runx2 能提高PI3K 信號通路的活性[32]，VEGF 則可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成，加速骨形成及重建過程，通過增加成骨細(xì)胞的成骨活性，降低破骨細(xì)胞溶骨活性來促進(jìn)骨形成及增加骨密度[33]。菟絲子活性成分通過調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)起到有效防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

3.4 主要通路分析

經(jīng)KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)了91 條通路（P≤0.05），與菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)通路有PI3K/Akt、MAPK、Wnt等。研究[34]表明PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、黏附以及細(xì)胞凋亡過程中起重要作用；PI3K/Akt 信號通路能刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，也可以抑制成骨細(xì)胞凋亡[35]。激活PI3K/Akt 信號通路可使下游關(guān)鍵性控制凋亡的因子如：FoxO1、Bad、Caspase-9、和 GSK-3β 磷酸化，從而起到抗凋亡的作用[36-37]。PI3K/Akt 和 BMP 通路、Runx2、FoxO 信號通路也有著緊密聯(lián)系，骨形成蛋白(BMPS)作為重要的自分泌和旁分泌生長因子，由成骨細(xì)胞合成并釋放，在骨形成和骨骼修復(fù)過程中起著不可替代的作用[38]。MAPK信號通路在成骨細(xì)胞生長發(fā)育過程中起著重要作用，研究[39-40]證實MAPK 通過作用于成骨細(xì)胞來調(diào)節(jié)骨形成，激活p38/MAPK 可增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和增加骨量[41]。Wnt/β-catenin 信號通路在防治骨質(zhì)疏松癥過程中發(fā)揮著重要的作用，軟骨細(xì)胞的增殖及分化，軟骨內(nèi)骨化，骨痂的吸收、重塑和改建等過程離不開Wnt/β-catenin 信號通路的參與，這些過程可通過上調(diào)Runx2 實現(xiàn)[32,42]。菟絲子黃酮能調(diào)節(jié)去卵巢大鼠Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)因子β-catenin、OPG、RANKL、DKK1 的水平，從而增加骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥狀[43]。KEGG 結(jié)果表明治療骨質(zhì)疏松的相關(guān)信號通路在一定程度上與其他信號通路間存在多種多樣的相互作用關(guān)系，提示治療骨質(zhì)疏松時應(yīng)在針對局部關(guān)鍵通路的基礎(chǔ)上，還需針對疾病產(chǎn)生的原因、疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)、機(jī)體所處環(huán)境，進(jìn)行多系統(tǒng)干預(yù)，這也體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病時追求的治病求本、標(biāo)本兼治的特色，進(jìn)一步證明中藥可對多個靶標(biāo)、多項通路進(jìn)行綜合干預(yù)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了中藥菟絲子預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果表明中藥菟絲子防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分可能有槲皮素、山奈酚、金絲桃苷、異鼠李素等，這些有效成分通過調(diào)控IL-6、Runx2、VEGFA、ESR1等靶點控制PI3K/Akt、MAPK、Wnt 等信號通路發(fā)揮藥效。確定了菟絲子治療骨質(zhì)疏松的直接和間接調(diào)控靶標(biāo)，以“有效成分-疾病靶標(biāo)”為基礎(chǔ)分析出其可能的作用機(jī)制。為后續(xù)機(jī)制的探討和實驗設(shè)計的優(yōu)化等提供了重要的理論基礎(chǔ)。本文也為相關(guān)作用機(jī)制的研究提供了思路和方法，尤其是分析中藥針對某種特定疾病的作用機(jī)制，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有科學(xué)性和指導(dǎo)性，為后續(xù)深入探討菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制提供了依據(jù)。同時，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也存在局限性：無法解決藥物代謝動力學(xué)、時辰藥理學(xué)等過程中可能發(fā)生的動態(tài)變化，因此部分預(yù)測結(jié)果及作用機(jī)制還需通過實驗考察證實，從而完善中藥治療疾病相關(guān)機(jī)制的研究。本課題組接下來將考察菟絲子對關(guān)鍵蛋白及基因的調(diào)控，深入揭示菟絲子治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，旨在為菟絲子防治骨質(zhì)疏松類新藥的機(jī)制研究及開發(fā)利用提供參考。