基于網(wǎng)絡藥理學的乳香-沒藥藥對藥效機制研究＊

周 宜，鄧藍冰，周游宇，孟祥龍

（1. 湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 長沙 410005；2. 山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院 晉中 030619）

乳香、沒藥配伍應用最早出現(xiàn)在《證治準繩》中的“乳香止痛散”[1]中。乳香性味辛、苦、溫，功效活血定痛，消腫生肌，側(cè)重行氣活血；沒藥性味辛、苦、平，功效散瘀定痛，消腫生肌，側(cè)重活血化瘀。兩者在臨床上經(jīng)常相須為用，協(xié)同增效，為治療臟腑、經(jīng)絡不通之要藥，對改善風濕痹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌打損傷瘀痛等疼痛具有較好的療效[2]。乳香、沒藥作為活血化瘀類常用中藥，二者經(jīng)常以藥對形式出現(xiàn)在臨床上，僅《中國人民共和國藥典》（1995 年版）和衛(wèi)生部頒發(fā)的中藥成方制劑標準中收載含乳香、沒藥的中成藥就有161個，因此臨床應用非常廣泛。

網(wǎng)絡藥理學是在系統(tǒng)生物學的理論指導下，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡分析的學科，是一個通過對多靶點藥物分子的分析，選取特定信號節(jié)點的過程。這個過程是通過多學科的技術(shù)和內(nèi)容進行融合來完成的,包括系統(tǒng)生物學、多向藥理學、生物信息學和計算機科學等學科，從而進行“藥物-靶點-疾病”等多層次網(wǎng)絡的構(gòu)建，藥物與疾病相關(guān)性研究，也可以闡明藥物作用機理，從而指導新藥的開發(fā)。因此，從上可知，網(wǎng)絡藥理學的研究視角和研究方法具有一定的整體性、系統(tǒng)性及復雜性，這幾個特點正好與中醫(yī)藥整體觀與辨證論治的原則不謀而合。乳香-沒藥藥對很早就出現(xiàn)在臨床應用中，一方面在治療疼痛方面療效顯著，另一方面隨著其不良反應報道的逐漸增多，藥理毒理方面的研究也取得了一些進展[3]。比如在臨床治療中，使用乳香-沒藥藥對治療后會刺激患者的皮膚，使得患者皮膚過敏或者會出現(xiàn)胃腸道反應，出現(xiàn)惡心嘔吐、食欲不振等[4]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學研究方法構(gòu)建乳香-沒藥藥對的“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡，對乳香-沒藥藥對治療抗?jié)?、抗炎[5]、抗腫瘤[6]、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛五種疾病的作用機制進行分析找出共性和高頻率的主要化合物、基因、靶點以及細胞通路解決或減少藥物的不良反應,為研究其作用機理和臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 乳香、沒藥成分收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php，TCMSP）[7]，以“乳香”、“沒藥”為關(guān)鍵詞檢索出乳香、沒藥中的化學成分。

1.2 活性化合物和靶標蛋白的篩選

目前對乳香-沒藥藥對和靶點的篩選無相關(guān)文獻及報道，本研究旨在對乳香-沒藥藥對全化合物進行活性化合物篩選，從而構(gòu)建“藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡，以此探究乳香-沒藥藥對的藥效機制所以不以生物利用度（OB）和類藥性（DL）進行篩選活性化合物。

1.3 疾病靶點的篩選

通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/,OMIM，）[8]，人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www. genecards. org/）[9]，分 別 以“ 抗 炎/Antiinflammatory”，“ 鎮(zhèn) 痛/Analgesia”，“ 抗 腫 瘤/Antitumor”，“ 抗 潰 瘍/Anti-ulcer”，“ 炎 癥 性 腸 病/Inflammatory bowel disease”為關(guān)鍵詞檢索與抗抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛相關(guān)的基因。

1.4 韋恩圖的構(gòu)建

分別將藥物和疾病靶點上傳至在線韋恩圖（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）, 在線得到活性化合物與抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛五種疾病的交集基因。

1.5 靶標蛋白基因名的確定及化合物-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

查詢靶標蛋白對應的基因名用到以下公開的免費數(shù)據(jù)庫，分別是全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫（UniProt，https://www.uniprot.org/）[10]、醫(yī)學文獻檢索服務系統(tǒng)（Pub Med，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）[11]，人類基因組數(shù)據(jù)庫（HGNC，https://www.genenames.org/）等，并用Cytoscape 3.7.1(http://cytoscape.org/)軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡，分析化合物和靶點間的度（degree）值。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（PPI）的構(gòu)建

借助蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫（STRING 11.0，https://string-db.org），將乳香-沒藥對與五種疾病的交集基因分別上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，在線獲取乳香-沒藥藥對與五種疾病的蛋白相互作用網(wǎng)絡。

1.7 核心靶點的通路分析

分別將乳香-沒藥藥對治療抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛的蛋白靶點上傳至生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），在線進行基因本體（GO）生物學過程富集分析和基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析,并借助Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）軟件繪圖，使其結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點和疾病靶點數(shù)據(jù)的篩選

以1.2 項下相關(guān)條件進行檢索，共篩選出乳香、沒藥中403 個化學成分和1949 個靶點蛋白；其中乳香化學成分占127 個，蛋白靶點占659 個。鑒于文章篇幅，故其活性化合物基本信息見附表1。

2.2 乳香-沒藥藥對與五種疾病的交集基因

按1.3項下，分別按照相關(guān)檢索條件將每種疾病的OMIM 數(shù)據(jù)庫與GeneCards 數(shù)據(jù)庫的在線檢索結(jié)果合并，得出五種疾病的相關(guān)基因靶點。通過數(shù)據(jù)庫找出乳香-沒藥藥對活性化合物247個活性靶點，抗?jié)?245個相關(guān)基因，抗炎873個相關(guān)基因，抗腫瘤1963個相關(guān)基因，炎癥性腸病4588個相關(guān)基因，鎮(zhèn)痛996個相關(guān)基因。

按1.4 項下，分別將藥物和疾病靶點上傳至在線韋恩圖得出乳香-沒藥與抗?jié)兿嚓P(guān)基因交集基因有181 個，與抗炎相關(guān)基因交集基因有120 個，與抗腫瘤相關(guān)基因交集基因有140 個，與炎癥性腸病相關(guān)基因交集基因有184 個，與鎮(zhèn)痛相關(guān)基因共有142 個，見圖1。乳香-沒藥藥對與五種基本高頻基因共有79 個見表1。乳香-沒藥與五種疾病交集基因列表見附表2。

2.3 “藥物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡的構(gòu)建

按1.5 項下相關(guān)操作，基于Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）軟件構(gòu)了建乳香-沒藥藥對與五種疾病的“藥物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡，見圖2。根據(jù)乳香-沒藥藥對與五種疾病的“藥物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡，總結(jié)出化合物所屬的類別，見圖3。

圖1 乳香-沒藥藥對與五種疾病的韋恩（Venn）圖

表1 乳香-沒藥藥對與五種疾病高頻基因

乳香-沒藥藥對針對上述五種疾病治療的藥效部位為揮發(fā)油類成分，如L-乙酸冰片酯（LBornyl acetate）、L-香芹酮（L-carvone）、β-波本烯（β-Bourbonene）、β-欖香烯（β-elemene）、大豆苷元（Daidzein）和桃金娘醛（myrtenal）等，在抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛五種疾病中揮發(fā)油類成分分別占87.50%、81.21%、80.00%、86.45%、78.65%，就此推知，揮發(fā)油類為乳香-沒藥藥對治療五種疾病的高頻化合物種類；另外高頻共性樹脂類成分主要有丁酸芳樟酯（linalyl butyrate）、α-古蕓香烯（α-gurjunene）、卡巴雌二醇（cabraleadiol）和 O-乙?；?β-乳香脂酸（O-acetyl-β-boswellic acid）等。

2.4 乳香-沒藥藥對與五種疾病的蛋白相互作用核心網(wǎng)絡（PPI）的構(gòu)建

按1.6 項下相關(guān)操作，借助蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫（STRING 11.0，https://string-db.org），分別構(gòu)建出乳香-沒藥與五種疾病的相互作用核心網(wǎng)絡圖（PPI），見圖 4，5 種疾病的 PPI 網(wǎng)絡圖分析，見附表3，乳香-沒藥藥對與五種疾病的高頻共性靶點，見表2。

乳香-沒藥藥對與五種疾病的PPI 網(wǎng)絡圖中心點均為蛋白激酶B1（AKT1），此外，頻率較高的蛋白還有白細胞介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等。

經(jīng)對比分析，共得到20個高頻共性靶點，其中，蛋白激酶B1（AKT1）通路是膜受體信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的主要信號通路，能對凋亡相關(guān)的蛋白進行調(diào)節(jié)，以維持細胞存活及增殖和抑制細胞凋亡[12]。蛋白激酶B（protein kinases B，PKB）作為信號轉(zhuǎn)導通路的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過而磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidyl inositol 3kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PI3K/PKB）是絲氨酸/蘇氨酸（Ser/ Thr）蛋白激酶家族的主要成員之一，其主要作用是調(diào)節(jié)信號途徑調(diào)節(jié)細胞代謝、細胞周期，促進細胞生長和增殖并抑制細胞凋亡的作用[13]并且能將細胞外刺激信號傳遞到細胞核，在周圍缺血半暗帶（ischemic penumbra，IP）區(qū)損傷級聯(lián)反應中發(fā)揮重要作用[14]。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，特別是在平衡新血管的形成并使血管通透性增加以及現(xiàn)有血管的維持和重塑方面起重要作用[15]。白細胞介素6（IL-6）是一種多效性的促炎細胞因子，可在多種自身免疫性疾病的病理過程中起重要作用[16]。

表2 乳香-沒藥藥對與五種疾病高頻靶點度值

圖3 乳香-沒藥藥對治療五種疾病的藥效化合物歸類

2.5 基因本體（GO）功能富集分析

按1.7 項下，分別將乳香-沒藥藥對治療抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗?jié)兒脱装Y性腸病的蛋白靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，在線得到五種疾病的GO 條目數(shù)其中抗?jié)儷@得166 條富集結(jié)果，抗炎癥獲得150 條富集結(jié)果，抗腫瘤獲得134 條富集結(jié)果，炎癥性腸病獲得157條富集結(jié)果，鎮(zhèn)痛疾病獲得157條結(jié)果。其可視化結(jié)果見圖5。得到8個高頻共性條目，分別為受體配體活性（receptor ligand activity）、輔因子結(jié)合（cofactor binding）、細 胞 因 子 受 體 結(jié) 合（cytokine receptor binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性（DNA-binding transcription activator activity）。其中血紅素結(jié)合（heme binding）是在線粒體及胞質(zhì)中協(xié)作完成，由此需要胞質(zhì)線粒體的物質(zhì)跨膜運輸，血紅素合成起始需要將胞質(zhì)中的甘氨酸及δ-氨基酮戊酸合成酶2（δaminolevulinatesynthase 2,ALAS2）運送進線粒體內(nèi)，而合成產(chǎn)物δ-氨基酮戊酸（δ-aminolevulinate,ALA）需要被運送出線粒體進入細胞質(zhì)[17]。泛素樣蛋白連接酶（ubiquitin-like protein ligase binding）屬于環(huán)指結(jié)構(gòu)域蛋白家族[18]，它能夠特異性識別并結(jié)合目標蛋白，主要包括 HECT 結(jié)構(gòu)域（homologous to E6-APCterminus,HECT）、環(huán)指結(jié)構(gòu)域和U 形箱式結(jié)構(gòu)域（U-box）蛋白三大家族；細胞因子可以分為淋巴因子（lymphokine）、單核因子（monokine）、非淋巴細胞（Non-lymphocyte），其中淋巴因子中IL-6的生物學功能具有多樣性，在機體的免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控、炎癥反應等過程中均發(fā)揮著重要的作用所以細胞因子活性（cytokine activity）與炎癥[19]相關(guān)。

2.6 基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

圖4 乳香-沒藥藥對與五種疾病的相互作用核心網(wǎng)絡圖（PPI）及高頻節(jié)點分析

按1.7 項下，分別將乳香-沒藥藥對治療抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗?jié)兒脱装Y性腸病的蛋白靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，在線得到五種疾病的KEGG 通路數(shù)其中抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病、鎮(zhèn)痛分別篩選到 158 條、148 條、148 條、153 條、151 條信號通路。其可視化結(jié)果見圖6。共得到6條高頻共性KEGG 通路，分別為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）、人 巨 細 胞 病 毒 感 染（Human cytomegalovirus infection）、糖尿病并發(fā)癥的AGERAGE 信 號 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-AKT 信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)皰疹病毒感染（Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection）包括病毒原發(fā)感染和病毒裂解期蛋白，它能夠誘導多種細胞因子的表達與分泌，如促血管生成因子和炎癥因子，并且促進病灶的血管生成、炎癥浸潤和腫瘤播散[20]。PI3K-AKT 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）過度表達和活化與腫瘤的進展密切相關(guān)。上游分子通過與PI3K 結(jié)合，使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而磷酸化激活Akt，Akt 的活化能調(diào)控其下游分子，參與腫瘤調(diào)控通路[21]。

圖5 乳香-沒藥藥對與五種疾病的基因本體（GO）功能富集分析

3 討論

到目前為止，有關(guān)乳香-沒藥藥對的化學成分和藥理作用研究較多，且研究比較深入透徹。乳香為橄欖科植物卡氏乳香樹（Boswellia carterii Birdw）。乳香最早記載于《明醫(yī)別錄》，其被列為上品，性味辛、苦，溫，入心、肝、脾經(jīng)[22]?，F(xiàn)代研究表明乳香中的主要化學成分包括揮發(fā)油（3%-8%）、樹脂（60%-70%）、樹膠（27%-35%）以及少量的雜質(zhì)[23]。沒藥（Com-miphore myrrha Engl）最早記載于宋代的《開寶本草》，來源于橄欖科植物地丁樹Commiphora myrrha Engl.或哈地丁樹Commiphora molmol Engl.的干燥樹脂。具有悠久的藥用歷史，為常用活血化瘀類中藥[24]，沒藥性味辛、苦，平，歸心、肝、脾經(jīng)，具有特異的香氣，善于活血止痛，消腫生肌?，F(xiàn)代的藥理學研究表明，沒藥的主要化學成分為樹脂、樹膠和揮發(fā)油等，且主要化學成分包括揮發(fā)油（2.5%-9.0%）、樹脂（25%-35%）、樹膠（57%-65%），水分及其它雜質(zhì)約為（3%-4%）[25]，具有抗炎、降血脂、鎮(zhèn)痛、保護肝臟等多種藥理作用。現(xiàn)代藥理學研究證明兩者均具有鎮(zhèn)痛、抑菌、抗胃潰瘍、抗氧化、降血脂抗炎、活血化瘀抗腫瘤等作用[26]。因此，乳香、沒藥的臨床配伍應用從中醫(yī)理論可以理解為藥物相互作用中的同氣相求，兩者的配伍藥效作用協(xié)同增效。

圖6 乳香-沒藥藥對與五種疾病的基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

基于網(wǎng)路藥理學特點與中醫(yī)整體觀和辨證論治的不謀而合，網(wǎng)絡藥理學方法在中藥潛在活性成分和作用靶點的預測及中藥作用機制的闡述的研究中已有廣泛的應用[27]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法，從整體角度體現(xiàn)出了乳香-沒藥藥對多成分、多靶標和多途徑的治療機制。

乳香與沒藥生品研末外用，能起到斂瘡生肌的作用，可以用來治療皮膚軟組織瘡瘍潰后久不愈的癥狀。由于生乳香、生沒藥具有氣味辛烈的特點，對胃腸道有較強的刺激性，容易引起嘔吐，故二者在臨床上普遍以炮制品內(nèi)服出現(xiàn)，能夠行氣、活血、止痛。二者生品經(jīng)醋制后刺激性大大減弱，便于內(nèi)服，且能夠增強活血止痛收斂生肌的功效[28]。 目前就二者藥效及刺激性部位尚存爭議，學者對二者炮制過程的內(nèi)在質(zhì)控化學部位莫衷一是，基于本研究推知揮發(fā)油類為乳香-沒藥藥對治療疾病的高頻化合物種類，在二者炮制加工過程中應考慮揮發(fā)油類成分的量變及質(zhì)變。其中L-乙酸冰片酯（L-Bornyl acetate）具有止瀉、止痛、抑制家兔離體腸運動、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[29]；β-欖香烯（β- elemene）能夠顯著抑制人結(jié)腸癌細胞（SW480）增殖，引起細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡，并抑制腫瘤細胞集落形成[30]。大豆苷元（Daidzein）是大豆異黃酮中的一類，目前的研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮具有誘導癌細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲以及抗腫瘤血管生成等作用[31]。 L-香芹酮（L- carvone）是一種從薄荷類物質(zhì)中提取出來的精油，屬于單萜類的天然產(chǎn)物，并廣泛應用在食品工業(yè)和化學工業(yè)中的一種重要的香料。同時，以香芹酮為原料，還可以合成一些具有較好的抗癌、殺菌活性的香芹酮衍生物[32]。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，建立了“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡、蛋白互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡、基因本體（GO）功能富集分析以及基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集的分析，并由此得出乳香-沒藥藥對與抗?jié)儭⒖寡?、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和炎癥性腸病五種疾病的20 個高頻共性靶點，GO 高頻共性條目8 個，6條KEGG 高頻共性通路，綜合以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)乳香-沒藥中的揮發(fā)油類成分是治療上述五種疾病的主要化學成分。

4 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法探究乳香-沒藥藥對在抗?jié)儭⒖寡?、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛這五種疾病治療過程中的共性作用機制以及高頻共性靶點、高頻共性基因、高頻共性KEGG 通路等，為其深入的活性成分研究和及臨床應用提供理論支撐和科學依據(jù)。