基于網(wǎng)絡藥理學的藏藥西紅花“治一切肝病”的藥理作用分析＊

潘 安，張 淼，史海熠，顧 健，趙 丹，史志龍＊＊

（1. 西南民族大學藥學院 成都 610041；2. 昭通市第一人民醫(yī)院 昭通 657000）

西紅花（Crocus sativusL.）原名番紅花，又名泊夫蘭，撒馥蘭。藏語名喀吉苦功、給薩熱、加央多間[1]，原產(chǎn)于伊朗、希臘、西班牙等中東及歐洲地區(qū)，唐代經(jīng)西藏傳至內(nèi)地[2]，故又稱藏紅花。西紅花作為藥用植物，在中醫(yī)與藏醫(yī)臨床應用中有著迥異的功效。藏醫(yī)藥經(jīng)典《晶珠本草》中記載“紅花治一切肝病”，通過配伍調(diào)劑組成的多種藏藥經(jīng)典組方[3]具有疏肝利膽、清熱解毒、健脾胃、利尿等功效。而中醫(yī)多用西紅花治療婦科疾病及跌打損傷[4]?，F(xiàn)代臨床研究表明其還具有抗精神失常[5-8]、抗腫瘤[9]、降血糖[10-11]等作用。

課題組前期對《四部醫(yī)典》《晶珠本草》《藏藥于方劑》等藏醫(yī)藥典籍中具有防治肝病功效的藏藥復方進行整理研究時發(fā)現(xiàn)，西紅花為使用頻次最高的藏藥，如七味紅花殊勝丸、二十五味松石丸、仁青芒覺、九味牛黃丸等藏藥成方制劑中均配伍西紅花，甚至在很多藏藥復方中西紅花均為治療肝膽疾病的核心藥味[12-13]。早在一千多年前藏醫(yī)就對肝膽疾病有了較為完整的診治方案[14]，然而由于藏醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學存在較大差異，限制了藏醫(yī)藥推廣，難以充分發(fā)揮藏醫(yī)藥的療效優(yōu)勢。本研究通過系統(tǒng)生物學方法，明確西紅花治療肝病的臨床應用范圍及作用機制，為豐富藏醫(yī)藥理論、擴大西紅花的應用范圍提供科學理論支撐。

1 方法

1.1 西紅花化學成分篩選及收集靶點

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺[15]（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集西紅花的化學成分，并結(jié)合其成分的專屬性、口服利用率、生物利用率等進行篩選。繪制化學成分三維結(jié)構(gòu)圖。上傳至PharmMaper 數(shù)據(jù)庫（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php）預測化合物靶點,并刪除重復項。

1.2 構(gòu)建“成分-預測靶點”網(wǎng)絡及分析

通過Cytoscape 3.7.1 軟件對西紅花的“成分-靶點”進行互作網(wǎng)絡的建立，并利用軟件中的Networkanalyzer進行拓撲學分析[16]。

1.3 PPI互作網(wǎng)絡分析及KEGG富集

將預測出的靶點復制到String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）的 Multiple proteins 中 ，Organism 選 擇Homo sapiens 進行分析，選擇互動數(shù)（interaction score）大于90%得到PPI互作網(wǎng)絡和KEGG通路。

1.4 肝病相關(guān)通路及肝病靶點

通過 KEGG 數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/）對“1.3”中保存的KEGG 通路進行檢索并結(jié)合文獻，確定與肝病相關(guān)度較高的通路。利用OMIM、Disgenet數(shù)據(jù)庫獲取病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝細胞癌、肝纖維化、肝硬化等常見肝病[17-18]的靶點，并將其與西紅花靶點進行對接。

1.5 “活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

建立“活性成分-靶點-疾病”數(shù)據(jù)庫，并導入Cytoscape 3.7.1軟件中，對其進行分析。

2 結(jié)果

2.1 成分及靶點的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索到70 種西紅花的化合物，參考其成分的專屬性、口服利用率、生物利用率等篩選出19 種目標化合物（表1），通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索的西紅花新苷甲（Crosatoside A）、紅花色素A（Safflor Yellow A）等均只存在于西紅花中；有研究表示西紅花可能的活性成分為藏紅花素（Crocin I、Crocin 2）、藏 紅 花 酸 （Crocetin）等[19-20]；通 過PharmMaper 數(shù)據(jù)庫篩選靶點后，得到了包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC、p38 絲裂原激活蛋白激酶類（p38MAPK）中的MAPK14 和細胞外蛋白配體表皮生長因子家族中的EGFR[21]等80個靶點。

2.2 構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡及分析

將藏藥西紅花成分與預測靶點導入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡（圖1）。西紅花“成分-靶點”網(wǎng)絡中共有19 個化合物，80 個靶點。靶點Average Degree 為 11.15，以 Degree ≥18 為條件篩選出10個西紅花可能的核心靶點（表2）。

表格 1 西紅花目標化合物

2.3 PPI互作網(wǎng)絡分析及KEGG通路富集

將80 個西紅花靶點導入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）得到PPI互作網(wǎng)絡（圖2），圖中的圈為靶點，其Degree值越大圈越大，度值從大到小,顏色由亮變暗；而邊的綜合得分越高邊越粗，綜合得分從大到小,顏色由亮變暗。并富集出149 條KEGG 通路。這些通路大部分都與癌癥、肝病有關(guān)，其中包括前列腺癌(Prostate cancer)、結(jié)腸直腸癌(Colorectal cancer)、胃癌（Gastric cancer）、肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma）、乙型肝炎（Hepatitis B）、丙型肝炎（Hepatitis C）等。

2.4 肝病相關(guān)通路及肝病靶點

利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/）結(jié)合相應文獻將149 條通路逐條檢索，篩選出12 條具有顯著意義（P＜0.01）且與肝病相關(guān)度較高的通路（圖3），其中Proteoglycans in cancer 通路可通過調(diào)控Glypicans、Agrin、Versican 等三種蛋白聚糖參與肝癌的發(fā)生及表達等過程[22-24]，此外該通路還參與多種類型腫瘤的增殖、黏附、血管生成和轉(zhuǎn)移等生物學過程。MAPK signaling pathway 中活化的ERK 亞族進入細胞核后通過激活相應轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控肝星狀細胞的細胞周期來影響其增殖所引起的肝纖維化[25-26]；PI3K-Akt signaling pathway 通過影響肝臟細胞外基質(zhì)、肝星狀細胞、肝竇毛細血管化參與肝纖維化[27]。Th17 cell differentiation 通路可分化產(chǎn)生IL-17 和IL-22，有研究表明IL-22 可以促進肝細胞存活，并刺激肝細胞產(chǎn)生急性期蛋白，促進肝細胞在感染或炎癥后的恢復過程[28-32]。經(jīng)過以上分析，可推測西紅花在肝癌、肝纖維化等方面具有潛在的藥物開發(fā)價值。

圖1 西紅花“成分-靶點”網(wǎng)絡圖

表 2 西紅花關(guān)鍵靶點及拓撲學分析

圖2 西紅花網(wǎng)絡藥理學中蛋白互作網(wǎng)絡圖

圖3 西紅花網(wǎng)絡藥理學中肝病相關(guān)通路分析

2.5 西紅花“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

建立“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡（圖4），結(jié)合此網(wǎng)絡的拓撲學分析結(jié)果與“成分-靶點”網(wǎng)絡、肝病相關(guān)通路的分析結(jié)果推斷出西紅花的關(guān)鍵靶點為SRC和EGFR。SRC 為酪氨酸蛋白激酶，有研究表明其在肝癌的治療中扮演著重要的角色[33]；EGFR 在肝細胞增殖、抗肝纖維化中都是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[34]。通過對“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的拓撲學分析發(fā)現(xiàn)西紅花對肝細胞癌和病毒性肝炎的靶點匹配率較高，特別是乙型肝炎，通過對Hepatitis B 通路的研究發(fā)現(xiàn)西紅花關(guān)鍵靶點SRC 參與了細胞的增殖與分化過程。

表3 西紅花網(wǎng)絡藥理學中疾病網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)

圖4 西紅花成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖

3 討論

西紅花在中醫(yī)理論中多用于治療婦科疾病，網(wǎng)絡拓撲學分析中發(fā)現(xiàn)的ESR1 可能同乳腺癌的治療有著密切的聯(lián)系[35]，并且富集出的通路中雌激素信號通路與靶點匹配程度較高。

西紅花在藏醫(yī)藥中的應用相比于中醫(yī)更為廣泛也更為悠久，在《晶珠本草》中記載“西紅花可治療一切肝病”，根據(jù)藏醫(yī)藥經(jīng)典《四部醫(yī)典》的核心理論三因?qū)W說——“隆、赤巴、培根”，將臨床上的每種肝病細分為“隆”盛型，“赤巴”盛型，“培根”盛型[36]，又因現(xiàn)代醫(yī)學理論上劃分肝病范圍與藏醫(yī)理論劃分肝病依據(jù)不同，通過本研究，我們初步對應了現(xiàn)代醫(yī)學理論西紅花治療肝病范圍與藏醫(yī)藥理論治療肝病的范圍。西紅花可以對各類常見肝病都具有一定的防治作用，根據(jù)《四部醫(yī)典》記載“赤巴”病入侵肝臟時，肌肉顏色呈青色、肝區(qū)疼痛、頭痛、眼痛、唾液粘稠等癥狀可對應現(xiàn)代醫(yī)學理論的肝腫瘤、病毒性肝炎等。

現(xiàn)今傳統(tǒng)藏醫(yī)藥由于宗教、文化、習俗等差異導致非藏區(qū)的人們對其接受度不高，限制了藏醫(yī)藥的發(fā)展。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法，對西紅花防治肝病的機制進行了初步闡述，明確了西紅花在臨床的用藥范圍，為西紅花的應用與推廣提供新的思路和科學支撐。