脂多糖致大鼠發(fā)熱特點(diǎn)與機(jī)制研究進(jìn)展＊

楊 彪 ，胡玉梅 ，劉文君 ，姜 濤 ，耿 婷 ，曹 亮 ，王振中 ，肖 偉 ＊＊

（1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

發(fā)熱是一種機(jī)體面對(duì)病原體入侵時(shí)產(chǎn)生的一種復(fù)雜的防御性反應(yīng)，是生物歷經(jīng)幾百萬年進(jìn)化而來的一種生存策略[1-2]。機(jī)體每升高1℃需增強(qiáng)10%～12.5%的代謝速度[3]，因此發(fā)熱通常伴隨一系列的“疾病行為”，如體溫升高、虛弱、疲倦等，而這些行為是為讓機(jī)體更快地恢復(fù)健康[4]。所以，發(fā)熱是一種生理反應(yīng)，而不是病理反應(yīng)。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌外壁的類脂質(zhì)多糖，其可通過與細(xì)胞表面Toll樣受體4（TLR-4）結(jié)合引發(fā)炎癥因子的大量表達(dá)，導(dǎo)致炎癥相關(guān)癥狀如紅、腫、熱、痛等，故常被用于誘導(dǎo)炎癥動(dòng)物模型及細(xì)胞模型的建立[5]。自Szekely 以來，LPS 致大鼠發(fā)熱模型被廣范運(yùn)用到發(fā)熱機(jī)制研究中，但由于多方面因素的影響，研究者得到的結(jié)果有所不同。因此，本文對(duì)LPS 引發(fā)大鼠發(fā)熱的特點(diǎn)與機(jī)制展開論述，為廣大實(shí)驗(yàn)人員在建立大鼠發(fā)熱模型及解熱作用研究等方面提供一些幫助。

1 LPS致大鼠發(fā)熱的特點(diǎn)及影響因素

1.1 特點(diǎn)

LPS 致大鼠發(fā)熱的時(shí)間-體溫曲線會(huì)隨LPS 劑量、外界環(huán)境溫度的變化呈單相、雙相乃至多相變化，每一相也被稱為發(fā)熱的不同階段[6]。通常LPS 致發(fā)熱的產(chǎn)生可分為兩個(gè)階段。一是發(fā)熱的起始階段，也稱第一階段，此階段具有發(fā)熱迅速、持續(xù)時(shí)間較短等特點(diǎn)。二為發(fā)熱的持續(xù)階段，這個(gè)階段包括除發(fā)熱起始階段之外后續(xù)的發(fā)熱過程，通常包括第二及第三階段，具有持續(xù)時(shí)間長、多相變化等特點(diǎn)。此外，兩個(gè)階段有著截然不同的機(jī)制。

1.2 影響因素

1.2.1 LPS的劑量

LPS 劑量對(duì)大鼠發(fā)熱過程中的體溫調(diào)節(jié)有著重要作用[7]。在外界環(huán)境溫度適中的情況下，LPS 濃度在 100～101μg·kg-1時(shí)引起單相體溫升高，LPS 濃度在101.5μg·kg-1時(shí)，體溫呈現(xiàn)雙相波動(dòng)，當(dāng) LPS 濃度達(dá)到101.75～104μg·kg-1時(shí)，發(fā)熱呈現(xiàn)出三相波動(dòng)，且隨 LPS濃度的升高，發(fā)熱持續(xù)時(shí)間延長、幅度增大[8]。

在一定劑量范圍內(nèi)LPS 致熱作用呈現(xiàn)劑量依賴性，但超出一定范圍后增加劑量并無作用[9]。劑量范圍跨度大：腹腔或靜脈注射10-1 000 μg/kg 不等，視模型需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整劑量[10]。通常注射劑量范圍20-250 μg/kg，引發(fā)雙相熱或三相熱，降低劑量呈單相熱，反復(fù)注射會(huì)致耐受[11]。內(nèi)毒素緩釋，例：LPS 膠原水凝膠注射可克服反復(fù)注射LPS導(dǎo)致的耐受，形成SD大鼠從高熱到持續(xù)低熱[12]。常見造模劑量有三個(gè)：20 μg/kg、80 μg/kg、100 μg/kg，80 μg/kg劑量出現(xiàn)最多。20 μg/kg引發(fā)雙相熱，80 μg/kg、100 μg/kg引發(fā)三相熱。動(dòng)物品系、生理狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等均的會(huì)影響峰值出現(xiàn)時(shí)間、最大峰值，80 μg/kg 和 100 μg/kg LPS 致發(fā)熱比20 μg/kg致發(fā)熱模型發(fā)熱的熱勢(shì)高，發(fā)熱時(shí)間長，利于觀察以及進(jìn)一步其他實(shí)驗(yàn)操作，例如給藥觀察等。常見劑量20 μg/kg、80 μg/kg、100 μg/kg LPS 致大鼠發(fā)熱模型體溫變化趨勢(shì)見表1[13-23]。

表1 常見劑量LPS致大鼠發(fā)熱模型體溫變化趨勢(shì)表

1.2.2 環(huán)境溫度

環(huán)境溫度對(duì)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的發(fā)熱過程有著重要的影響，尤其是對(duì)體型較小的物種，如大鼠，很小溫度的差別均能產(chǎn)生重大影響，甚至可使體溫降低變成發(fā)熱。而且，不同溫度環(huán)境下，LPS致大鼠發(fā)熱過程有著明顯的區(qū)別。在29-31℃環(huán)境中，靜脈注射LPS 引起明顯的發(fā)熱，在低濃度時(shí)，LPS引起一個(gè)單相的體溫升高，當(dāng)劑量升高后，LPS 引起幾個(gè)連續(xù)的體溫升高過程。而在一個(gè)溫度較低的環(huán)境中（26℃），同樣低濃度的LPS 引起雙相的發(fā)熱，隨著LPS 濃度的升高會(huì)導(dǎo)致低體溫現(xiàn)象出現(xiàn)[24]。

1.2.3 注射方法

通常實(shí)驗(yàn)者采用腹腔或靜脈注射LPS 進(jìn)行造模，而這種方法會(huì)讓大鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的緊張和疼痛感，這種情況會(huì)造成大鼠的體溫波動(dòng)1-3℃，并且持續(xù)30-120 min，對(duì)后續(xù)的體溫監(jiān)測(cè)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，并使正常的發(fā)熱起始階段被掩蓋或使單相發(fā)熱被認(rèn)為是雙相發(fā)熱，具有嚴(yán)重的欺騙性。而且不同的給藥方法也會(huì)對(duì)發(fā)熱產(chǎn)生的時(shí)間有較大影響[25]。

1.2.4 其他

除上述三個(gè)主要因素之外，還有一些因素可能會(huì)造成影響，如大鼠的性別、品系、造模前禁食禁水與否、實(shí)驗(yàn)者注射手法熟練程度等。其中，雌性大鼠的荷爾蒙水平會(huì)直接影響發(fā)熱反應(yīng)。

2 發(fā)熱的不同階段及機(jī)制

2.1 發(fā)熱的起始階段

早期發(fā)熱理論認(rèn)為發(fā)熱的起始階段是由內(nèi)致熱源經(jīng)血液循環(huán)通過血腦屏障作用于大腦發(fā)揮作用[26]，后經(jīng)實(shí)驗(yàn)[27]證實(shí)，內(nèi)致熱源如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等在LPS 注射后的30-60 min 才出現(xiàn)在血液循環(huán)中，而此時(shí)發(fā)熱已產(chǎn)生。隨后補(bǔ)體系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)以及迷走神經(jīng)傳輸理論成為發(fā)熱起始階段的關(guān)鍵因素，并受到廣范認(rèn)可。通常發(fā)熱的起始階段發(fā)生在LPS注射后15 min，并在1 h 左右達(dá)到峰值[28]。起始階段的潛伏期會(huì)隨著LPS劑量的增加而有所縮短，幅度也會(huì)有所增加。

2.1.1 起始階段的關(guān)鍵因素

2.1.1.1 Kupffer細(xì)胞（Kc）

Kc 是機(jī)體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，存在于肝臟中，擔(dān)任著LPS 代謝清除的任務(wù)。同時(shí)，它也是TLR-4 的主要供體細(xì)胞以及補(bǔ)體因子5a（C5a）的作用細(xì)胞，在發(fā)熱的啟動(dòng)過程和終止過程中起到重要的作用。L 等[29]采用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記LPS，觀察到發(fā)熱起始階段的體溫升高與Kc 攝取FITC 標(biāo)記的LPS 密切相關(guān)。

2.1.1.2 補(bǔ)體系統(tǒng)的激活

補(bǔ)體系統(tǒng)是自身免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，它可被病原體及其代謝產(chǎn)物迅速激活[30]。靜脈注射LPS 可在2 min內(nèi)引起補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起各種細(xì)胞因子的生成，且大多數(shù)炎癥因子白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6、前列腺素 E2（PGE2）和 TNF-α 等與發(fā)熱密切相關(guān)[31]。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活過程主要發(fā)生在Kc 細(xì)胞中，如圖1 所示。補(bǔ)體C 代謝生成補(bǔ)體C3，補(bǔ)體C3進(jìn)一步代謝生成C5a，C5a通過與補(bǔ)體因子5a受體（C5aR）結(jié)合啟動(dòng)磷脂酶C（PLC）水解生成花生四烯酸（AA），接著AA在環(huán)氧酶-1/2（COX-1/2）的作用下生成PGE2和前列腺素D2（PGD2）等[32]。Li等[33]通過基因敲除及C5aR受體拮抗劑證實(shí)了C5a在發(fā)熱的起始過程中起到重要作用。

2.1.1.3 肝臟傳入迷走神經(jīng)與去甲腎上腺素（NE）

肝臟傳入迷走神經(jīng)元表面表達(dá)有前列腺素EP3受體[34]，可與C5a誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGE2結(jié)合，通過迷走神經(jīng)將信號(hào)向下丘腦前區(qū)（POA）傳送。Simons 等[35]研究發(fā)現(xiàn)肝臟迷走神經(jīng)切斷術(shù)可阻斷發(fā)熱產(chǎn)生及PGE2升高，證實(shí)了肝臟迷走神經(jīng)在發(fā)熱起始過程中有著重要的作用。Kc-PGE2信號(hào)傳入POA 后會(huì)刺激NE 的釋放，引起棕色脂肪代謝及皮膚收縮，導(dǎo)致發(fā)熱。同時(shí)生成的NE 會(huì)刺激PGE2的生成，值得注意的是此處生成的PGE2是由神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元本身及樹突小棘產(chǎn)生[36-37]。

圖1 發(fā)熱起始階段信號(hào)傳導(dǎo)通路圖

2.1.1.4 激活內(nèi)源性Kalikrein-kinin系統(tǒng)

研究[38]發(fā)現(xiàn) LPS 激活內(nèi)源性 Kalikrein-kinin 系統(tǒng)導(dǎo)致Bradykinin(BK)產(chǎn)生，其作用于POA 細(xì)胞的B2 受體導(dǎo)致前列腺素合成，進(jìn)而產(chǎn)生發(fā)熱。

2.1.1.5 信號(hào)傳導(dǎo)過程

如圖1 所示，LPS 進(jìn)入機(jī)體后隨血液循環(huán)至肝臟（Liver）中，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生PGE2，產(chǎn)生的PGE2通過與肝臟傳入迷走神經(jīng)元（Hepatic vagus neuron）的EP3受體結(jié)合將信號(hào)傳入到非顫栗產(chǎn)熱（NST）細(xì)胞群A1和A2后，再通過腹側(cè)的NE能神經(jīng)束進(jìn)一步傳遞到POA，引起NE的釋放，NE通過與溫敏神經(jīng)元上的腎上腺素受體α1（α1-AR）結(jié)合，引起棕色脂肪代謝及皮膚收縮，產(chǎn)生快速發(fā)熱。

2.2 發(fā)熱的持續(xù)階段

關(guān)于發(fā)熱持續(xù)階段的機(jī)制有過不同的理論，目前最被學(xué)者認(rèn)可的是血腦屏障（BBB）在發(fā)熱的持續(xù)中產(chǎn)生重要的作用[39]。研究[40]發(fā)現(xiàn)BBB 周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均含有TLR-4 受體，而且大腦內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有TNF-α、IL-1、IL-6 受體。這些均表明BBB 不是信號(hào)傳導(dǎo)的障礙而是信號(hào)的產(chǎn)生者，在發(fā)熱的持續(xù)階段具有重要的地位。

2.2.1 持續(xù)階段涉及的關(guān)鍵因素

2.2.1.1 LPS的識(shí)別—TLR-4的激活

大多數(shù)病原體有著高度相似的組成結(jié)構(gòu)，被稱為“病原體相關(guān)分子模式”，而這些結(jié)構(gòu)會(huì)通過TLRs 家族激活機(jī)體的自身免疫系統(tǒng)。其中，TLR-4 是LPS 的同源受體，常在表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表面。LPS與LPS連接血清蛋白（LPB）結(jié)合后，在CD14分子作用下與由MD2 分子作用激活的TLR-4結(jié)合，過程中還涉及到MyD88、IRAK和TRAP6等因子，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB），生成多種炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6等）、黏附因子以及一些炎癥相關(guān)的酶[一氧化氮合成酶（iNOS）、環(huán)氧酶-2（COX-2）、前列腺素合成酶（mPGES-1）等][41-43]。研究[44-45]采用基因敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)TLR-4基因敲除C3H/HeJ大鼠不能對(duì)LPS刺激產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)，證實(shí)了TLR-4 在發(fā)熱中的重要作用。

2.2.1.2 內(nèi)致熱源的產(chǎn)生

內(nèi)致熱源最初由Beeson[46]提出，主要是指由外致熱源，如LPS，誘導(dǎo)下由機(jī)體自身產(chǎn)生的，促使發(fā)熱的因子，多是炎癥因子。在發(fā)熱過程中，無論是LPS 與TLR-4 結(jié)合激活NF-κB，還是補(bǔ)體系統(tǒng)，都可導(dǎo)致炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6 等）的產(chǎn)生。研究[47-49]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射 LPS 后30-60 min，TNF-α，IL-1，IL-6 相繼在血液中出現(xiàn)。而且，TNF-α與IL-1可相互促進(jìn)彼此的生成，兩者都可促進(jìn)IL-6 生成，而IL-6 能抑制TNF-α 與 IL-1 生成。TNF-α、IL-1、IL-6 主要在發(fā)熱的維持階段起到作用，與發(fā)熱的起始階段無關(guān)。其中，IL-6對(duì)機(jī)體免疫功能有促進(jìn)作用。

2.2.1.3 PGE2的生成與傳導(dǎo)

PGE2是公認(rèn)的發(fā)熱介質(zhì)之一[43]。PGE2與下丘腦部位的EP3受體結(jié)合是維持發(fā)熱的重要過程。其代謝過程主要由細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2 作用下水解生成的 AA 經(jīng) COX 及 mPGES 代謝生成。在 LPS 誘導(dǎo)的發(fā)熱過程中，COX-2 和mPGES-1 不僅在大腦部位的巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)，而在肝臟和肺部的巨噬細(xì)胞中也大量表達(dá)[50]。采用抑制前列腺素（PG）合成的藥物以及COX-2或mPGES-1缺陷小鼠均可抑制發(fā)熱產(chǎn)生[51]。同時(shí)，在發(fā)熱的持續(xù)階段，肝臟部位的PGE2代謝酶表達(dá)量降低，促進(jìn)了PGE2向大腦的轉(zhuǎn)移[52]。

2.2.1.4 EP3受體

EP3受體在下丘腦視前區(qū)大量表達(dá)[53]。PGE2受體與EP3在腦部結(jié)合是發(fā)熱產(chǎn)生的必要條件之一[54]。Michael 等[55]研究表明PGE2與處于內(nèi)側(cè)視前核的神經(jīng)元表達(dá)的EP3受體結(jié)合是發(fā)熱產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。

2.3 信號(hào)傳導(dǎo)過程

發(fā)熱持續(xù)階段的PGE2可分為兩部分，一部分由外周生成轉(zhuǎn)移至大腦，另一部分由大腦部位自身生成。兩部分的產(chǎn)熱機(jī)制基本相同，都是通過LPS 直接或間接作用而產(chǎn)生。過程如圖2 所示。血液循環(huán)中的LPS通過與外周巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等表面的TLR-4 受體結(jié)合并激活NF-κB 產(chǎn)生各種炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 等，生成的炎癥因子可通過 PLA2-AA-PGE2產(chǎn)生PGE2。同時(shí)，炎癥因子及LPS 可直接與大腦內(nèi)皮細(xì)胞表面受體（TLR-4R、IL-1R、IL-6R）結(jié)合，產(chǎn)生PGE2，機(jī)制與外周相同。外周生成的PGE2通過BBB進(jìn)入中樞，同BBB 處生成的PGE2共同與神經(jīng)元的EP3受體結(jié)合，生成NE，繼而引起棕色脂肪代謝增加，血管收縮等反應(yīng)，引起發(fā)熱。

3 小結(jié)

LPS致大鼠發(fā)熱模型現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種解熱實(shí)驗(yàn)中，充分了解LPS 致大鼠發(fā)熱的特點(diǎn)與機(jī)制對(duì)實(shí)驗(yàn)者有著重要的幫助。本文對(duì)LPS致大鼠發(fā)熱過程中的影響因素進(jìn)行了總結(jié)，主要包括LPS的劑量、環(huán)境溫度以及注射的方法，把控好這些因素會(huì)對(duì)模型的建立以及實(shí)驗(yàn)的可靠性提供一定的幫助。在模型建立的過程中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕o予 LPS 劑量在 101.75～104μg·kg-1范圍內(nèi)維持發(fā)熱的穩(wěn)定性。可通過控制通風(fēng)、空調(diào)等條件嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度在25℃左右，一定不能高于體溫。同時(shí)，在給藥及測(cè)量體溫的過程中，實(shí)驗(yàn)操作者對(duì)大鼠的抓取要經(jīng)過練習(xí)，最好是使大鼠習(xí)慣操作者的抓取動(dòng)作，避免因抓取使大鼠產(chǎn)生掙扎導(dǎo)致體溫的變化。最后，條件較好的情況下可采用皮下植入體溫測(cè)定裝置，以計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)監(jiān)控大鼠的體溫變化，這里需要注意，手術(shù)植入體溫測(cè)定后需要對(duì)大鼠進(jìn)行至少一周的消炎處理，避免其發(fā)生炎癥反應(yīng)。

在了解發(fā)熱特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，本文對(duì)LPS 致大鼠發(fā)熱的機(jī)制進(jìn)行了初步總結(jié)。發(fā)熱可分為兩個(gè)階段，一是起始階段，二是持續(xù)階段。兩個(gè)階段有著不同的特點(diǎn)并有著不同的機(jī)制。在發(fā)熱的起始階段，LPS 通過肝臟Kc 中的補(bǔ)體系統(tǒng)快速生成PGE2，PGE2激活肝臟迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元、NST，最終將信號(hào)傳入POA，生成NE，引起發(fā)熱。在發(fā)熱的持續(xù)階段中，LPS 通過與TLR-4 受體結(jié)合激活NF-κB 產(chǎn)生各種炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 等，這些炎癥因子以及 LPS 通過與大腦部位的細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等部位的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)COX-2 生成PGE2，PGE2通過與神經(jīng)元EP3 受體結(jié)合，傳導(dǎo)信號(hào)至POA，引發(fā)NE 釋放，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)熱。雖然研究將發(fā)熱分為兩個(gè)階段，并在時(shí)間上存在先后關(guān)系，但兩個(gè)階段并非相互獨(dú)立，兩者也是同時(shí)進(jìn)行并相互影響的。

圖2 發(fā)熱持續(xù)階段信號(hào)傳導(dǎo)通路圖

目前對(duì)發(fā)熱的機(jī)制研究已較為明確，但仍然存在一些疑問，比如低溫環(huán)境中高劑量LPS 導(dǎo)致低體溫現(xiàn)象的機(jī)制是什么？替代激活的脂肪中巨噬細(xì)胞在LPS致發(fā)熱中有什么作用？這些問題仍需科研人員進(jìn)一步研究解答。本文對(duì)LPS致大鼠發(fā)熱機(jī)制進(jìn)行了一定的總結(jié)，希望對(duì)科研人員在建立LPS 致大鼠發(fā)熱模型中所遇到的問題有所幫助。