基于16S rRNA測(cè)序技術(shù)初步探討多囊卵巢綜合征大鼠腸道菌群多樣性

肖慧，劉艷霞，征征，邢雅雯，邢玉

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是女性最常見的一種生殖內(nèi)分泌疾病[1]，可影響18%的育齡期女性[2]。PCOS以高雄激素血癥(hyperandrogenism)、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和持續(xù)無(wú)排卵為主要臨床特征。引起近80%無(wú)排卵性不孕[3],且患子癇前期、妊娠糖尿病、流產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥及心理疾病、心血管疾病、子宮腫瘤等遠(yuǎn)期并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[4]。PCOS發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，近年來(lái)大量研究表明，腸道菌群在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用。最新研究表明，移植PCOS患者腸道菌群的小鼠表現(xiàn)出胰島素抵抗、生育力下降、卵巢組織中小卵泡增多和黃體減少等現(xiàn)象，而移植正常人群腸道菌群的小鼠，并無(wú)上述表現(xiàn)，提示腸道菌群與PCOS密切相關(guān)[5]。而基于16S rRNA高通量基因測(cè)序技術(shù)，觀察來(lái)曲唑聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的PCOS大鼠腸道菌群多樣性的特點(diǎn)，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究復(fù)制來(lái)曲唑聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型，以16S rRNA高通量基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)PCOS大鼠腸道菌群多樣性進(jìn)行OTU分析、α多樣性分析、Beta多樣性分析、物種差異分析等，闡明PCOS腸道菌群的特點(diǎn)，為深入探討PCOS的發(fā)病機(jī)制及中藥的作用靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物及分組： SPF級(jí)雌性SD大鼠12只[北京維通利華，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)20166-0006]，21日齡，體質(zhì)量50～70 g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組及模型組，每組6只。屏障環(huán)境喂養(yǎng)。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料加0.3%膽固醇、10%豬油(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，動(dòng)物倫理審查批號(hào)(BUCM-4-2018101001-4030)。(2)實(shí)驗(yàn)藥物：來(lái)曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。(3)儀器及試劑：離心機(jī)(恒諾儀器 AXTGL16M)、切片機(jī)(Leica RM2235)、石蠟包埋機(jī)(Leica G1150H)、 I-Sanger生信云平臺(tái)(https://www.i-sanger.com/)，促黃體生成素(LH)測(cè)定試劑盒、促卵泡激素(FSH)測(cè)定試劑盒、血清雄激素(T)測(cè)定試劑盒、血清泌乳素(PRL)測(cè)定試劑盒、血清孕酮(P)測(cè)定試劑盒、血清雌激素(E2)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年10月—2019年3月于北京中醫(yī)藥大學(xué)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PCOS大鼠模型的建立：來(lái)曲唑1 mg·kg-1·d-1溶于1%羧甲基纖維素(CMC)中，模型組大鼠連續(xù)灌服42 d，予高脂飼料喂養(yǎng)；對(duì)照組大鼠同期灌服等容積等濃度的基質(zhì)CMC，予普通飼料喂養(yǎng)。大鼠雄激素水平升高且卵巢HE染色提示卵巢呈多卵泡樣改變，表明PCOS大鼠造模成功。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清學(xué)性激素指標(biāo)水平檢測(cè)： 大鼠最后一次給藥后，禁食12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥1 ml/100 g,大鼠昏迷后，75%酒精消毒腹部皮膚，打開腹腔,腹主動(dòng)脈取血4 ml， 離心取血清，以放射免疫法檢測(cè)血清性激素6項(xiàng)：T、E2、FSH、LH、P、PRL水平。

1.3.2 卵巢形態(tài)學(xué)觀察：選取大鼠右側(cè)卵巢，4%多聚甲醛固定，卵巢組織HE染色，制作石蠟切片，光鏡下觀察卵巢組織學(xué)特點(diǎn)。

1.3.3 腸道菌群多樣性檢測(cè)： 基于16S rRNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)[6]。(1)采集各組大鼠結(jié)腸糞便。(2)使用DNA 提取試劑盒提取每個(gè)糞便樣本中總DNA。(3)以細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4可變區(qū)序列為靶標(biāo)，以帶有barcode 序列的338F-806R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取PCR產(chǎn)物。(4)PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)定量后，通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端，回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，構(gòu)建MiSeq文庫(kù)；利用 Illumina MiSeq PE300等平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4 可變區(qū)堿基序列信息。(5) OTU分析，OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元(品系，屬，種，分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。利用 QIIME 軟件，對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控及 OTU聚類，獲取 OTU 對(duì)應(yīng)的分類單元(包括門、綱、目、科、屬、種)及其相應(yīng)的豐度信息。(6)α多樣性分析，Shannon指數(shù)是描述一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)多樣性的度量指數(shù)，通過(guò)計(jì)算Shannon指數(shù)評(píng)估樣品中細(xì)菌菌群的豐富度和均勻度。(7)主成分分析(principal component analysis，PCA)是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化分析的技術(shù)，可以有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)。(8)物種差異分析，應(yīng)用LEfSe多級(jí)物種差異判別及組間差異比較，分析各組大鼠腸道微生物群落表現(xiàn)出的豐度差異。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清性激素指標(biāo)水平比較 模型組雄激素(T)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，余指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 2組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)比較 模型組卵巢可見多個(gè)不成熟小卵泡，小卵泡周圍顆粒細(xì)胞層數(shù)較少，未見成熟卵泡及黃體；而對(duì)照組卵巢內(nèi)可見少數(shù)成熟大卵泡，成熟卵泡顆粒細(xì)胞層較厚，內(nèi)可見卵丘，卵巢內(nèi)可見多個(gè)黃體，見圖1。

2.3 腸道菌群多樣性比較 每組各有1只大鼠標(biāo)本不合格，故最終行16S rRNA高通量基因測(cè)序的樣本為每組5只。

2.3.1 OTU分析及物種組成分析： 2組大鼠共有OTU數(shù)431個(gè)，模型組特有122個(gè)，對(duì)照組特有132個(gè)。根據(jù)OTU聚類的結(jié)果，可獲得2組大鼠在門、綱、目、科、屬、種及OTU水平的豐度信息，其中， PCOS模型組與對(duì)照組大鼠門、科、屬水平群落Bar圖見圖2～4。

2.3.2 α多樣性分析： 模型組和對(duì)照組的Shannon指數(shù)分別為2.767 5和3.083 5， 2組腸道菌群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.268)。

2.3.3 PCA分析： 剔除遠(yuǎn)離總體的部分樣本后，PCA結(jié)果表明，對(duì)照組和模型組腸道菌群組成有明顯差異。PC1和PC2軸對(duì)結(jié)果的解釋度分別為59.38%和21.15%，見圖5。

2.3.4 物種差異分析

2.3.4.1 門水平菌群豐度比較 2組大鼠腸道門水平菌群豐度比較(前10位)， 菌群組成以厚壁桿菌門和擬桿菌門為主。對(duì)照組擬桿菌門占(41.26±3.60)%，厚壁桿菌門占(50.88±3.67)%；模型組擬桿菌門占(19.88±5.65)%，厚壁桿菌門占(66.48±3.93)%。與對(duì)照組比較，模型組擬桿菌門豐度顯著降低(t=-2.951,P=0.033)，厚壁桿菌門豐度升高(t=2.800，P=0.038)，見圖6。

2.3.4.2 擬桿菌門/厚壁桿菌門的比值 對(duì)照組為0.83±0.13，大于模型組的0.39±0.11。2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.378，P=0.020)。

圖2 2組大鼠門水平群落Bar圖

表1 2組大鼠血清性激素水平比較

注：紅色箭頭所示為卵泡，黑色箭頭所示為黃體。對(duì)照組卵巢內(nèi)可見多個(gè)黃體和優(yōu)勢(shì)卵泡，優(yōu)勢(shì)卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)較多，且可見卵丘(對(duì)照組放大100倍紅色箭頭所示)；模型組卵巢內(nèi)可見大量小卵泡，小卵泡周圍顆粒細(xì)胞層數(shù)較少，僅可見少數(shù)黃體，未見優(yōu)勢(shì)卵泡

圖1 2組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)情況比較(HE染色)

圖3 2組大鼠科水平群落Bar圖

圖4 2組大鼠屬水平群落Bar圖

2.3.4.3 屬水平菌群豐度比較 與對(duì)照組比較，模型組Alloprevotella(屬普氏菌科)、擬桿菌屬(Bacteroides)、Ruminococcaceae_UCG-005(屬瘤胃菌科)、Ruminiclostridium-6(屬瘤胃菌科)、Prevotellaceae_NK3B31_group-6(屬普氏菌科)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、Bacteroides pectinophilus group(屬梭菌目，毛螺菌科)豐度均顯著減少，Romboutsia(屬梭菌目，消化鏈球菌科)、Parasutterella(屬變形菌門)和Lachnoclostridium(屬梭菌目，毛螺菌科)豐度均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。前10位有豐度差異的屬水平菌群見圖7。

圖5 2組大鼠PCA分析結(jié)果

2.3.4.4 LEfSe多級(jí)物種層級(jí)樹圖 LEfSe是一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)識(shí)和揭示基因組特征的軟件，包括基因、代謝和分類。該軟件使用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和驗(yàn)檢，檢測(cè)具有顯著豐度差異特征，并找到與豐度有顯著性差異的類群。紅色和藍(lán)色節(jié)點(diǎn)分別表示在模型組和對(duì)照組中顯著富集，且組間差異存在顯著影響的微生物類群；淡黃色節(jié)點(diǎn)表示在不同分組中均無(wú)顯著差異，或組間差異無(wú)顯著影響的微生物類群。與對(duì)照組比較，PCOS模型組大鼠腸道菌群中門、綱、目、科、屬、種等各個(gè)水平的擬桿菌門的豐度均減少，包括屬水平的Allpprevotella、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、普氏菌屬等，厚壁菌門中瘤胃菌科的多個(gè)屬水平及種水平的菌群豐度減少。與對(duì)照組比較，模型組大鼠厚壁菌門梭菌目中的科、屬、種水平的梭菌均增多；厚壁桿菌門中各個(gè)分類水平的丹毒絲菌均增多，消化鏈球菌科、屬、種水平的Romboutsia均增多,毛螺菌科中多個(gè)種屬水平的菌群豐度增多；放線菌門中目、科、屬、種水平的紅蝽菌均增多；變形菌門中，種和屬水平的Parasutterella均增多。

3 討 論

腸道菌群在人類健康中起著重要作用，被稱為“成人的第二大腦”，腸道菌群基因又被看作“人類第二基因組”[7]。近年來(lái)大量研究表明，腸道菌群在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用，提出了通過(guò)干預(yù)腸道菌群以防治疾病新的臨床策略。

為避免外界環(huán)境對(duì)腸道菌群的影響，腸道菌群多樣性檢測(cè)的標(biāo)本為結(jié)腸中的糞便。多個(gè)臨床研究表明[8-9]，與正常女性比較，PCOS患者腸道菌群α多樣性降低。最新研究發(fā)現(xiàn)[10]，PCOS患者高雄激素血癥與α多樣性呈負(fù)相關(guān)。本研究對(duì)照組α多樣性指數(shù)高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來(lái)曲唑聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象。Kelley等[11]用來(lái)曲唑誘導(dǎo) PCOS 小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS小鼠體內(nèi)腸道菌群物種的多樣性和豐度減少，主要表現(xiàn)為擬桿菌屬(Bacteroides)豐度顯著減少(所有OTU水平的擬桿菌豐度均減少)，而梭菌屬豐度增多，這與本研究結(jié)果一致。也有研究采用Real-time PCR方法檢測(cè)腸道菌群，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠的乳酸菌、瘤胃球菌屬、梭菌減少，而普氏菌增多[12]。與本研究結(jié)果不完全一致，可能與2項(xiàng)研究應(yīng)用的檢測(cè)方法、造模方法不盡相同有關(guān)。

Allpprevotella可以降解糖類，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，研究表明[13-14]，其豐度與肥胖、糖尿病、心血管疾病和代謝綜合征呈負(fù)相關(guān)。PCOS為代謝相關(guān)疾病，常合并肥胖、胰島素抵抗等，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，PCOS大鼠腸道菌群中Allpprevotella豐度下降，因此Allpprevotella的豐度可作為改善腸道菌群，防治PCOS的潛在靶標(biāo)之一。擬桿菌屬作為一種常見益生菌，對(duì)宿主健康起著重要作用，如促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化，抑制炎性反應(yīng)，影響宿主的免疫系統(tǒng)等[15]。副擬桿菌屬是可以參與代謝調(diào)節(jié)的益生菌，研究表明，狄氏副擬桿菌(parabacteroides distasonis)可通過(guò)產(chǎn)生琥珀酸鹽和次級(jí)膽汁酸緩解肥胖,降低血糖，緩解脂肪肝。普氏菌屬是和高植物飲食相關(guān)的益生菌，大麥仁飲食調(diào)控血糖的作用可能與增加普氏菌豐度有關(guān)[16-17]。瘤胃菌作為一種短鏈脂肪酸的產(chǎn)生菌，可以降解多種多糖和纖維，其豐度與腸道通透性、酗酒、肝性腦病、非酒精性肝硬化均呈負(fù)相關(guān)[18]。研究表明，多種疾病與梭菌屬有關(guān)，如假膜性結(jié)腸炎、嬰兒型肉毒中毒、破傷風(fēng)、急性水樣腹瀉、壞死性小腸結(jié)腸炎等。Parasutterella與慢性腸道炎性反應(yīng)有關(guān)[19-20]。紅蝽菌科是神經(jīng)性厭食癥患者腸道菌群中惟一豐度增加的菌群。高脂飲食可以增加丹毒絲菌的豐度[21-22]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，PCOS大鼠擬桿菌屬、副擬桿菌屬、普氏菌屬、瘤胃菌科等益生菌豐度減少，而梭菌屬、Parasutterella、紅蝽菌科等有害菌群豐度增加，丹毒絲菌的豐度增加可能與模型組大鼠高脂飲食相關(guān)。

圖6 2組門水平菌群豐度比較

圖7 2組屬水平菌群豐度比較

腸道菌群可以通過(guò)產(chǎn)生活躍的信號(hào)分子影響宿主免疫、代謝及生殖功能。其中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是最重要的分子之一，又稱內(nèi)毒素，是腸道革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分，引發(fā)了炎性反應(yīng)相關(guān)過(guò)程[23-25]。益生菌豐度減少，有害菌群豐度增加，導(dǎo)致腸道菌群紊亂，進(jìn)而致腸黏膜受損，腸道通透性增加，LPS進(jìn)入循環(huán)，激活細(xì)胞表面的Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)，進(jìn)而介導(dǎo)多個(gè)炎性信號(hào)通路，包括激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路，誘導(dǎo)TNF-α、IL-18、IL-6等促炎因子的分泌[26-28]。而升高的TNF-α、IL-18、IL-6均可以通過(guò)調(diào)控胰島素相關(guān)信號(hào)通路，引起胰島素累積，增多的胰島素進(jìn)一步導(dǎo)致卵巢產(chǎn)生更多的雄激素，干擾正常卵泡的發(fā)育，從而加劇PCOS的發(fā)生。這可能是腸道菌群紊亂加劇PCOS的潛在機(jī)制之一。明確PCOS發(fā)病的潛在機(jī)制，可為其防治提供新的臨床策略。

此外，調(diào)節(jié)腸道菌群是中藥口服治療疾病的機(jī)制之一，研究表明，中藥可以增加益生菌的豐度,三萜類化合物如人參皂苷、甘草苷、桔梗皂苷等，黃酮類化合物如槲皮苷、黃芩苷等，環(huán)烯醚萜類化合物如當(dāng)歸苷、芍藥苷等均可增加擬桿菌和雙歧桿菌的豐度。黃連素可以提高小鼠腸道菌群中擬桿菌/厚壁桿菌的比值，增加擬桿菌豐度。靈芝可降低肥胖小鼠腸道菌群中厚壁桿菌/擬桿菌比值和變形桿菌的豐度[29-31]。PCOS是中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)病種，此研究可為進(jìn)一步探究PCOS的中醫(yī)藥防治提供新思路和研究基礎(chǔ)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地探究來(lái)曲唑聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的PCOS大鼠腸道菌群多樣性的特點(diǎn)。研究結(jié)果表明，PCOS大鼠腸道菌群存在菌群失調(diào)的現(xiàn)象，擬桿菌門豐度減少，厚壁桿菌門豐度增加，擬桿菌門/厚壁桿菌門的比值降低，Allpprevotella、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、普氏菌屬、瘤胃菌科等益生菌豐度減少，而梭菌屬、Parasutterella、紅蝽菌科等有害菌群豐度增加。此為進(jìn)一步探究PCOS的防治提供新思路。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

肖慧：實(shí)施研究過(guò)程，數(shù)據(jù)收集、分析，論文撰寫；劉艷霞：提出研究方向，指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)，指導(dǎo)論文寫作，論文審核；征征：協(xié)助實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)收集；邢雅雯：協(xié)助數(shù)據(jù)分析；邢玉：提出研究思路和研究選題，設(shè)計(jì)研究方案、研究流程，設(shè)計(jì)論文框架，論文修訂及審核