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    內(nèi)異方對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠核因子-κB信號通路相關(guān)因子的影響

    2020-04-16 03:05:16宋曉婕周艷艷趙莉娜
    中國老年學(xué)雜志 2020年7期
    關(guān)鍵詞:方組內(nèi)異烯酮

    宋曉婕 周艷艷 趙莉娜

    (河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450002)

    子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是常見的婦科良性疾病,是由本該長在子宮腔的內(nèi)膜細(xì)胞通過輸卵管進入盆腔異位生長引發(fā)的,以疼痛、進行性加重盆腔粘連和不孕為主要臨床表現(xiàn)的一類疾病,給女性的生理和心理帶來極大負(fù)擔(dān)〔1〕。目前關(guān)于子EM的發(fā)病機制是臨床研究熱點之一,核因子(NF)-κB參與細(xì)胞免疫、應(yīng)激和凋亡的調(diào)節(jié),在EM的發(fā)生、進展中扮演著重要角色〔2〕。內(nèi)異方是針對EM行氣化瘀,軟堅消癥的經(jīng)驗藥方〔3〕,本文為探討內(nèi)異方治療EM對NF-κB信號通路的影響,對EM模型大鼠采用內(nèi)異方干預(yù)15 d后進行相關(guān)mRNA、蛋白表達(dá)和血清因子檢測。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物 選取無特定病原體級雌性成熟未孕SD大鼠(由廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供)80只,大鼠體重為200~300 g,鼠齡為7~10 w。實驗動物的處理按照醫(yī)學(xué)動物倫理相關(guān)規(guī)定〔4〕給予人道主義關(guān)懷,給予自由飲水和飲食,室內(nèi)溫度設(shè)置為22℃,濕度50%,每天12 h光照。

    1.2藥物配制 孕三烯酮(華潤紫竹藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H19980020,規(guī)格:2.5 mg×8粒/盒),去除外部膠囊后,將粉末溶于蒸餾水混勻,配制成濃度為0.032 mg/ml的孕三烯酮混懸液,置于4℃冰箱備用。內(nèi)異方(由炒當(dāng)歸、丹參、赤芍、制香附、血竭、川牛膝等12味中藥構(gòu)成,共100.5 g)是由河南省中醫(yī)院中藥房提供,用蒸餾水洗凈,煎煮,過濾和濃縮為3.58 g/ml藥液,冷卻后置于4℃冰箱備用。

    1.3建模 將80只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、內(nèi)異方組和孕三烯酮組,每組20只,除空白對照組外,將其余3組大鼠自體子宮內(nèi)膜移植于腸系膜上建立 EM大鼠模型,具體方法為:術(shù)前2 d肌內(nèi)注射4 mg/2 ml的苯甲酸雌二醇(天津金耀藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H12020529,規(guī)格:1 ml∶1 mg),使大鼠處于相同動情周期,禁食12 d后,超凈臺內(nèi)操作大鼠,采用水合氯醛(10%自配滅菌)行腹腔麻醉,開腹后找到子宮,游離左側(cè)子宮行結(jié)扎后切除1 cm長度的子宮段放入無菌生理鹽水中,切割成4片后縫合在右側(cè)腸系膜血管豐富處,腹腔留置青霉素鈉(廣州白云山天心制藥,國藥準(zhǔn)字H44022448,規(guī)格160 IU×20瓶)0.25 ml,縫合腹腔壁,分籠飼養(yǎng)。術(shù)后3 d連續(xù)每天1次注射青霉素鈉0.25 ml,術(shù)后第2天肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg。

    1.4分組給藥 空白對照組與模型組給予0.2 ml生理鹽水,每天1次灌胃,內(nèi)異方組根據(jù)大鼠體重給予配置好的內(nèi)異方藥液35.88 g/kg,每天1次灌胃,孕三烯酮組根據(jù)大鼠體重給予孕三烯酮備用混懸液0.325 mg/kg,每周2次灌胃,4組均連續(xù)干預(yù)15 d。

    1.5觀察和檢測指標(biāo) 藥物干預(yù)結(jié)束后,對大鼠采血,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清學(xué)指標(biāo):白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1b、腫瘤壞死因子(TNF)-α、神經(jīng)生長因子(NGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。處死大鼠后開腹,觀察比較建模3組內(nèi)異灶數(shù)目和體積,并對盆腔粘連程度進行評分〔1〕:粘連面積<25%計為1分,25%≤粘連面積<50%計為2分,粘連面積≥50%計為3分;粘連程度疏松、無血管粘連計為1分,致密粘連、血管粘連計為2分,無組織界面粘連計為3分;無卵巢粘連計為0分,卵巢單側(cè)粘連計為1分,卵巢雙側(cè)粘連計為2分。以粘連面積、粘連程度和卵巢粘連3個方面分?jǐn)?shù)相加計為粘連評分。

    取建模3組EM病灶附著點周圍腹膜組織,空白對照組留取盆腔正常腹膜組織,生理鹽水清洗后,將每塊組織分為2份。1份組織采用免疫組化的方法檢測組織中NF-κB、NF-κB抑制因子(IκB)和IκBs激酶(IκK)的蛋白相對表達(dá)量,另一份采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)(RT-PCR)測定NF-κB、IκB和IκK的mRNA定量。

    1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.13組建模大鼠給藥后盆腔內(nèi)異灶數(shù)目、體積和粘連程度評分比較 給藥干預(yù)15 d后內(nèi)異方組和孕三烯酮組盆腔粘連評分、內(nèi)異灶數(shù)目和體積明顯小于模型組(P<0.05),內(nèi)異方組與孕三烯酮組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    2.24組給藥后IκK、IκB、NF-κB mRNA表達(dá)量比較 與空白對照組相比,其余3組腹腔組織IκK和NF-κB mRNA的含量明顯升高,IκB mRNA含量顯著降低(均P<0.05);與模型組相比,孕三烯酮組與內(nèi)異方組IκK和NF-κB mRNA含量均明顯降低,而IκB mRNA含量明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);內(nèi)異方組對三種 mRNA含量的改善程度明顯優(yōu)于孕三烯酮組(P<0.05)。見表2。

    表1 3組建模大鼠給藥后盆腔內(nèi)異灶數(shù)目、體積粘連評分比較

    與模型組比較:1)P<0.05

    表2 4組給藥后IκK、IκB、NF-κB mRNA表達(dá)量比較

    與空白對照組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05;與孕三烯酮組比較:3)P<0.05;下表同

    2.34組給藥后IκK、IκB、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組相比,其余3組腹腔組織IκK和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高,IκB 蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與模型組相比,孕三烯酮組與內(nèi)異方組IκK和NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯減少,而IκB蛋白的表達(dá)水平增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);內(nèi)異方組對三種蛋白表達(dá)水平的改善程度明顯優(yōu)于孕三烯酮組(P<0.05)。見表3。

    2.44組給藥后血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF比較 與空白對照組相比,模型組血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平明顯升高(P<0.05);孕三烯酮組與內(nèi)異方組血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平明顯低于模型組(P<0.05),內(nèi)異方組上述血清指標(biāo)改善程度均顯著優(yōu)于孕三烯酮組(P>0.05)。見表4。

    表4 4組給藥后血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平比較

    3 討 論

    西醫(yī)在治療EM主要采用手術(shù)和激素類藥物,存在一定局限性,難以根治。中醫(yī)目前主要用于EM的保守治療或結(jié)合西醫(yī)的輔助治療,本研究采用的內(nèi)異方是根據(jù)蔡莊治療EM加以總結(jié)而來的經(jīng)驗方,采用血竭破除積血,生心血,海藻、炙甲片活血、軟堅散結(jié),皂角刺、川牛膝、赤芍、丹參、桂枝活血祛瘀,炒當(dāng)歸、制香附調(diào)經(jīng)止痛,干漆消散癥瘕,諸藥配伍合奏行氣破瘀、軟堅消癥功效〔5~7〕。

    NF-κB是一種蛋白復(fù)合物,幾乎存在于所有動物細(xì)胞中,參與細(xì)胞應(yīng)激、免疫和凋亡等過程的調(diào)節(jié),已有研究表明NF-κB在EM患者中表達(dá)異常,是EM重要的病因?qū)W因素之一〔8,9〕。本研究結(jié)果顯示IκB能抑制NF-κB的表達(dá),而IκK則通過使IκB的N端亞基磷酸化從而被降解,降低NF-κB活性及表達(dá),并促使相關(guān)促炎因子表達(dá)與分泌下調(diào)〔10〕。本研究結(jié)果說明內(nèi)異方和孕三烯酮都能抑制內(nèi)異灶生長,降低盆腔粘連程度。內(nèi)異方如前面提到的具有活血軟堅功效,孕三烯酮屬于雄激素衍生物,有抗孕激素、雌激素和性腺激素的效果,由于EM具有雌激素依賴性,孕三烯酮能通過降低雌激素水平使其萎縮,達(dá)到治療效果〔11,12〕。內(nèi)異方組改善幅度高于孕三烯酮組,提示內(nèi)異方可能通過抑制IκK和上調(diào)IκB基因的表達(dá),來抑制NF-κB蛋白的合成發(fā)揮其療效,而孕三烯酮對NF-κB的調(diào)節(jié)作用沒有內(nèi)異方顯著。

    異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞NF-κB被激活,可以促進巨噬細(xì)胞釋放促炎因子IL-6、IL-1b,同時NF-κB又是VEGF基因啟動中的關(guān)鍵調(diào)控因子,它正向調(diào)節(jié)VEGF從而促進血管生成,血管生成常伴隨了神經(jīng)的生長,NGF是介導(dǎo)異位子宮內(nèi)膜神經(jīng)生長的重要因子,NGF水平相應(yīng)升高,進一步導(dǎo)致EM病變發(fā)生和進展〔13,14〕。本研究提示,孕三烯酮組直接改善大鼠血清學(xué)指標(biāo),而內(nèi)異方能通過NF-κB信號通路下調(diào)血清炎性因子和血管神經(jīng)相關(guān)因子水平從而降低大鼠體內(nèi)炎癥水平〔15〕。

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