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    玉米矮稈突變體K125d的遺傳鑒定

    2020-04-16 03:37:26石海春李開兵余學(xué)杰袁繼超曲比伍合柯永培
    華北農(nóng)學(xué)報 2020年1期
    關(guān)鍵詞:矮稈株高多態(tài)性

    石海春,陳 立,李開兵,余學(xué)杰,袁繼超,曲比伍合,柯永培

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 四川 溫江 611130; 2.四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司, 四川 雙流 610213;3.雅安市科學(xué)技術(shù)和知識產(chǎn)權(quán)局, 四川 雅安 625000;4.畢節(jié)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州 畢節(jié) 551700)

    矮稈緊湊型玉米具有抗倒伏、耐密和適宜機械化生產(chǎn)等特點[1-4],但目前可供利用的玉米矮稈基因資源比較單一,遺傳基礎(chǔ)狹窄,主要集中在br2[5-7]。進一步發(fā)掘新的玉米矮稈資源、加強矮化基因的鑒定與利用,為矮稈、緊湊、耐密優(yōu)良玉米雜交種的選育提供物質(zhì)和技術(shù)儲備,對玉米矮化育種具有十分重要的意義[8-13]。根據(jù)MaizeGDB數(shù)據(jù)庫資料,控制玉米株高的有近250個QTLs,分布在10 條染色體上;已報道玉米矮稈單基因如br、br-2、bv和D8等60多個,大部分為隱性基因,但基因D8、D9、D(t)[14]、D*-10[15]、D11[16]等為顯性單基因,基因br-2[17]、an1[18]、D8[19]、D9[20]、d3[21]和D(t)[22]等已成功克隆。本研究以矮稈突變體K125d為主要研究材料,從主要性狀表現(xiàn)、矮稈性狀的遺傳模式、控制該矮稈性狀的基因定位與克隆等方面,進行系統(tǒng)的遺傳評價,以期明確該突變體在玉米矮化育種方向的應(yīng)用價值,為其應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 供試材料

    矮稈突變體K125d(P1),7個測驗種(P2),以及構(gòu)建的正反交F1、B1、B2和F2共6個世代群體。7個測驗種名稱及主要特征為,K211(K125d同源高稈)、K123d和626(矮稈)、K365和K363(中稈)、K305和K236(高稈)。以上材料均由四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司(以下簡稱公司)提供。

    1.2 試驗設(shè)計

    1.2.1 K125d與K211形態(tài)差異比較 在公司四川雙流育種基地種植K125d和K211,選取有代表性的30個單株考察株高等主要農(nóng)藝性狀;成熟時,在各材料小區(qū)中間收獲有代表性的30個果穗曬干,于室內(nèi)考查主要經(jīng)濟性狀;對植株進行拍照對比。

    1.2.2 K125d矮稈性狀遺傳模式分析 試驗在四川雙流和雅安2個生態(tài)點進行。其中,每個點種植P1和P2群體各36株,正反交F1群體各84株;將籽粒最多的B1和B2果穗平均分成2份,在2個點全播;F2群體每試驗點均播種336粒。對分離群體進行株高鑒定,用χ2檢驗株高分離比例適合性,確定其遺傳模式。

    1.2.3 K125d矮化基因定位 定位群體為(K236×K125d)F2,在公司四川雙流育種基地播種1 400粒,為擴大定位群體規(guī)模,將上述用于遺傳模式分析的群體也用于定位使用。單株編號掛牌,分別判定高、矮株類型并登記。采用集團分離分析法(Bulked segregation analysis,BSA)[23]進行基因定位,在定位群體中各選取10株極高和極矮單株提取DNA并等量混合,構(gòu)建高稈和矮稈基因池。選取由上海生工生物工程股份有限公司合成的458對SSR引物(查自Maize Genetics and Genomics Database,http://www.maizegdb.org),用于親本K236和K125d間的多態(tài)性引物篩選;然后在高稈和矮稈基因池間,進一步篩選多態(tài)性標記,篩選出可能與矮稈連鎖的分子標記;再用定位群體中的典型高稈和典型矮稈植株各10株進行驗證;最后用定位群體中的255個矮稈單株進行擴增。用2×CTAB法提取DNA并純化,PCR反應(yīng)體系用25 μL,PCR擴增產(chǎn)物用3% 瓊脂糖凝膠進行電泳,用凝膠成像系統(tǒng)成像后觀察統(tǒng)計帶型,用MAPMAKER 3.0軟件進行連鎖分析,用MAPDraw V2.1[24]繪制遺傳連鎖圖譜。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 K125d與K211主要性狀比較

    K125d與K211的植株對比見圖1,可見K125d植株葉片密集重疊,節(jié)間短、株高和穗位高較矮??挤N結(jié)果表明,它們的果穗均為筒型、白軸、籽粒半馬齒型,K211籽粒黃色,K125d籽粒白色。將它們主要農(nóng)藝和經(jīng)濟性狀比較結(jié)果列于表1,可見,與K211相比,K125d生育期極顯著變長;株高、穗位高和葉夾角分別降低53.07%,71.46%和21.81%,均達極顯著水平;但葉片數(shù)和葉寬均極顯著增加,其增加比例分別為22.75%和15.15%,其余農(nóng)藝性狀差異不顯著;就主要經(jīng)濟性狀來看,K125d雖然穗長、穗粗和穗行數(shù)差異不顯著,但行粒數(shù)和百粒質(zhì)量卻顯著或極顯著降低,造成單株產(chǎn)量極顯著降低34.41%。

    A.植株;B.莖稈;h.K211;d.K125d;標尺為10 cm。

    表1 K125d與K211形態(tài)差異比較

    注:±.標準誤; 2 組處理數(shù)據(jù)后的英文字母不同,則表示這2 組處理間的數(shù)據(jù)差異顯著,小寫字母代表P=0.05水平差異顯著;大寫字母代表P=0.01水平差異顯著。

    Note:±.SE; If the English letters of the two groups were different,the difference between the two groups was significant difference, lowercase letters means significantly different atP=0.05;Capital letters means significantly different atP=0.01.

    2.2 突變體K125d株高的遺傳分析

    2.2.1 F1正反交群體株高表現(xiàn) 將K125d配制的7個F1正反交群體株高表現(xiàn)列于表2??梢?,所有正反交F1群體在2個試驗點均表現(xiàn)為高稈,且正、反交群體平均株高無顯著差異,說明K125d株高遺傳表現(xiàn)無細胞質(zhì)效應(yīng),即該矮稈性狀可能由核基因調(diào)控。另外,除用測驗種K211配制的組合K125d×K211外,測驗種株高越高,其相應(yīng)的F1群體株高也有增高趨勢,即用高稈測驗種配制的組合其平均株高高于中稈、中稈高于矮稈;雅安點F1株高比雙流點有增高的趨勢,表明F1株高由雙親遺傳背景共同控制,并受生態(tài)環(huán)境影響。

    表2 正反交F1群體的株高表現(xiàn)

    2.2.2 F2和回交群體的株高頻次分析 將F2和回交群體的植株高度作分布頻次分析,結(jié)果為用K125d回交的所有B1和F2群體的植株高度均表現(xiàn)為雙峰分布;B2群體(用K123d回交的B2除外)均表現(xiàn)高稈,表明K125d矮稈性狀由多基因控制的可能性不大。

    2.2.3 回交群體的株高分離比例分析 將用K125d構(gòu)建的7個B1回交群體和用K123d構(gòu)建的B2回交群體的株高分離比例結(jié)果列于表3。可見,在四川雙流和雅安,7個B1回交群體均出現(xiàn)高矮分離,分離比例符合1∶1;用626、K211、K236、K305、K363和K365等測驗種構(gòu)建的6個B2回交群體在2個生態(tài)點均表現(xiàn)為高稈,表明可能由1對隱性核基因控制K125d的矮稈性狀。至于用K123d構(gòu)建的B2回交群體出現(xiàn)高矮分離,分離比例符合1∶1,其原因可能是控制K125d和K123d矮稈性狀的基因不等位。

    表3 回交群體的株高表現(xiàn)χ2檢驗

    注:臨界t值,χ20.05(1)=3.84,χ20.01(1)=6.63。表4同。

    Note: The criticaltvalue,χ20.05(1)=3.84,χ20.01(1)=6.63.The same as Tab.4.

    2.2.4 F2群體的株高分離比例分析 將用K125d構(gòu)建的7個F2群體的株高分離結(jié)果列于表4??梢姡蠪2群體在雅安和雙流2個生態(tài)點株高分離規(guī)律表現(xiàn)一致,除(K125d×K123d)F2群體外,其余6個F2群體植株高矮分離符合3∶1,進一步表明由1對隱性核基因控制K125d的矮稈性狀。而(K125d×K123d)F2群體植株高矮分離比例為9∶7,符合2對隱性單基因控制同一性狀分離比例,表明控制K125d和K123d矮稈性狀的隱性單基因不等位。

    綜合分析表明,K125d與7個不同株高自交系配制的F1正反交群體,在2個試驗點均表現(xiàn)為高稈,其對應(yīng)正、反交群體間的株高差異不明顯,證明控制K125d矮稈性狀的基因無胞質(zhì)效應(yīng);除K123d外(br2類型)[11],與其余6個不同株高自交系配制的B1回交群體,高、矮稈分離比例為1∶1,B2回交群體全為高稈,F(xiàn)2群體高、矮稈分離比例為3∶1,充分證明K125d的矮稈性狀受1對隱性核基因控制,暫命名為d125。用K125d和K123d構(gòu)建的回交群體B1、B2及自交F2群體,其群體植株高矮分離,比例分別為1∶1、1∶1和9∶7,符合由2對互補隱性基因控制株高遺傳表現(xiàn)的分離比例規(guī)律,表明基因d125與br2可能不等位。

    表4 F2群體株高表現(xiàn)的χ2檢驗

    2.3 矮稈基因d125的定位

    基因定位群體為(K125d×K236)F2,選取均勻覆蓋10條玉米染色體上的SSR引物458對,篩選出在雙親間多態(tài)性較好的引物109對;進一步在高、矮稈基因池間對這109對引物進行多態(tài)性篩選,其中多態(tài)性表現(xiàn)較好的引物為umc2235。以引物umc2235分布的位置為參考,選擇并合成位于玉米第一條染色體1.05~1.09位置區(qū)間的SSR引物153對繼續(xù)進行多態(tài)性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)bnlg1619、umc1085、umc1278、umc1601、umc1689、umc1035、umc2560、umc2569和umc2387等9對引物在高、矮稈基因池間均表現(xiàn)出多態(tài)性,至此,共篩選出在高、矮基因池間具有多態(tài)性的SSR引物10對。

    用上述10對SSR引物,對255個矮稈單株DNA,分別進行PCR擴增,用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物,用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果照相,統(tǒng)計10對引物對定位群體中所有矮稈單株DNA擴增帶型。擴增結(jié)果連鎖分析用作圖軟件MAPMAKER 3.0,將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離用Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)化,引物與矮稈基因d125的連鎖關(guān)系用“Group”命令(LOD值大于3.0,重組率小于50%)判斷,各標記間的圖距用MAP命令計算,用MAPDraw V2.1 構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。結(jié)果為,矮稈基因d125,初步定位于1號染色體上,介于umc2569和umc1278 2個SSR分子標記之間,其遺傳距離分別為6.6,5.1 cM(圖2)。

    圖2 矮稈基因d125的遺傳連鎖圖譜

    2.4 矮稈基因d125的克隆

    根據(jù)定位結(jié)果,位于標記umc2569和umc1278附近的已知矮稈基因有5個,br2(bin 1.06)、br1(bin 1.07)、d*-N1352B(bin 1.06)、smp*-N706A(bin 1.06)和d*-N454A(bin 1.06),在MaizeGDB中搜索相關(guān)信息發(fā)現(xiàn)僅有br2關(guān)聯(lián)有基因模型,因此以br2作為候選基因進行克隆。

    根據(jù)br2基因模型GRMZM2G315375設(shè)計了8對重疊引物(圖3-A),用于擴增br2的5個外顯子區(qū)域。克隆結(jié)果如圖3-B所示,可見引物d125-8從K125d中擴增產(chǎn)物比K211約小250 bp(圖3-B中的箭頭所示);對擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果如圖3-C所示,可見d125在第1 651個堿基處有一個9 bp片段的插入,在第6 438堿基處有一個232 bp片段的缺失。通過DNAMAN對編碼序列進行翻譯顯示,d125插入的9個堿基編碼谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)和甘氨酸(G),該位置不在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)(圖3-D中三角形所示);而缺失導(dǎo)致從第1 288個氨基酸后產(chǎn)生移碼突變(如圖3-D的箭頭所示),該突變區(qū)域在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)的注釋為與各種細胞活動有關(guān)的ATP酶,而在P-糖蛋白(P-glycoprotein,PGP)中為核酸結(jié)合域(Nucleotide binding domain,NBD),該功能域功能主要是為PGP轉(zhuǎn)運提供能量。

    圖3 矮稈基因d125克隆結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    3.1 矮稈突變體K125d株高的遺傳模式

    玉米矮稈基因的遺傳一般分為單基因和多基因2種遺傳模式[25-26],針對一個新的矮稈資源,常用與其他自交系構(gòu)建的F1、B1、B2和F2群體的株高分離表現(xiàn)情況,來分析判斷其遺傳模式,如張素梅等[14]于2007年就做過類似研究。本研究用矮稈突變體K125d與同源自交系K211以及2個矮稈、中稈和高稈自交系,構(gòu)建的正反交F1,回交B1、B2和自交F2群體分析其遺傳模式,結(jié)果為K125d矮稈性狀受1對隱性核基因控制,命名為d125。

    3.2 矮稈基因d125初步定位結(jié)果

    MaizeGDB已收錄矮稈基因60多個,定位在玉米1號染色體上的有11個?;騜r2是發(fā)現(xiàn)較早且研究較多的玉米矮稈基因,該基因與生長素的合成相關(guān),已被成功克隆[17]。筆者將矮稈基因d125初步定位在1號染色體umc2569和umc1278 SSR分子標記之間,其距離分別為6.6,5.1 cM,在染色體上的位置與矮稈基因br2(bin 1.06)和br1(bin 1.07)等相近。

    3.3 矮稈基因d125序列及功能預(yù)測

    br2是目前應(yīng)用較多的玉米矮稈基因,編碼1個PGP蛋白,由兩部分組成,各部分均包含了6個假定的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個細胞內(nèi)的ATP結(jié)合域,并具有各自的功能[27]。已克隆得到的br2等位基因中,br2-6、br2-7和br2-9均在外顯子1有插入,br2-3在內(nèi)含子4中有插入[17],br2-23在第6 667個堿基處有8 bp缺失[28],株高QTL-qph1中SNP5259(T)編碼的氨基酸帶點性質(zhì)改變可能使蛋白與底物結(jié)合能力下降[29],高粱中與br2同源的dw3,其在外顯子5上有一個882 bp單元的直接重復(fù),使得該基因功能缺失[17],致使編碼蛋白功能散失。d125在第6 438堿基處缺失232 bp,包含了br2-23中的缺失部分,缺失產(chǎn)生移碼突變,這部分位于PGP蛋白和ABC轉(zhuǎn)運蛋白中的NBD內(nèi)。NBD的功能主要是為PGP轉(zhuǎn)運提供充足的能量,而保守的結(jié)構(gòu)域保證ATP結(jié)合與水解[30],2個Walker結(jié)構(gòu)中任一個突變導(dǎo)致功能完全喪失[31],而D125蛋白中也具有這個保守結(jié)構(gòu)。此外,NBD含有約215個氨基酸構(gòu)成的核心區(qū),核心區(qū)內(nèi)的部分氨基酸是保守的,對整個蛋白質(zhì)的功能具有極其重要的作用[32]。Walker B附近的小片段可能直接或間接地參與底物相互作用和NBD到跨膜域間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),是PGP蛋白中底物結(jié)合的主要位點[17]。d125在Walker B后移碼,造成的功能位點缺失可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)運功能喪失的主要原因。

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