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    常壓室溫等離子體誘變選育核黃素高產(chǎn)突變株

    2020-04-16 03:23:20祝金山吳燁飛陸建衛(wèi)
    發(fā)酵科技通訊 2020年1期
    關(guān)鍵詞:核黃素突變率致死率

    祝金山,吳燁飛,陸建衛(wèi)

    (浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司,浙江 嘉興 314400)

    核黃素(Riboflavin)又名維生素B2,化學(xué)名稱7,8-二甲基-10-(D-1-核糖基)異咯嗪,結(jié)構(gòu)式為C17H20N4O6[1]。核黃素是一種人和動(dòng)物必需的水溶性維生素,研究表明核黃素的缺乏會(huì)導(dǎo)致急慢性腸胃炎、潰瘍等消化道病變[2],甚至?xí)黾踊寄承┌┌Y的風(fēng)險(xiǎn),如食道癌、宮頸癌等[3-4]。另外,核黃素對(duì)一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如帕金森癥、偏頭痛、多發(fā)性硬化等)具有抑制作用[5]。微生物發(fā)酵法是目前唯一被核黃素工業(yè)化生產(chǎn)采用的方法,常用的生產(chǎn)菌有棉囊阿舒氏酵母和枯草芽孢桿菌兩種。國內(nèi)核黃素生產(chǎn)廠家廣濟(jì)制藥有限公司利用一株枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌,發(fā)酵周期70 h,終產(chǎn)物中核黃素質(zhì)量濃度達(dá)到26.5 g/L,是現(xiàn)有報(bào)道的工業(yè)化生產(chǎn)核黃素的最高水平[6-7]。目前國內(nèi)外對(duì)于核黃素生產(chǎn)菌的研究主要集中于基因工程菌的構(gòu)建,常規(guī)誘變育種方法鮮有報(bào)道,但大部分構(gòu)建的工程菌需要使用抗生素基因,導(dǎo)致核黃素工業(yè)化生產(chǎn)中易產(chǎn)生抗生素濫用問題,嚴(yán)重影響核黃素在醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域的使用安全[8]。

    常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變技術(shù)具有獨(dú)特的SOS修復(fù)機(jī)制,對(duì)微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性作用明顯,是一種高效、清潔的誘變技術(shù)[9-10],廣泛應(yīng)用于微生物誘變育種[11-12]。筆者采用常壓室溫等離子體對(duì)本公司保藏的核黃素生產(chǎn)菌進(jìn)行誘變處理,以期獲得穩(wěn)定、高產(chǎn)的核黃素生產(chǎn)菌。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 出發(fā)菌株

    枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)QJVB-1,浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司保藏菌種。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    斜面/分離平板培養(yǎng)基:葡萄糖18 g/L,蛋白胨3 g/L,酵母粉2 g/L,瓊脂粉15 g/L,pH 6.7~6.9。

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,玉米漿干粉6 g/L,尿素2 g/L,pH 6.5~6.7。

    搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖30 g/L,菜籽油10 g/L,黃豆粉10 g/L,玉米漿干粉10 g/L,NaCl 2.5 g/L,pH 6.5~6.7。

    5 L罐培養(yǎng)基:基礎(chǔ)配方同搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。

    補(bǔ)料培養(yǎng)基:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的葡萄糖。

    1.1.3 儀 器

    SGD-4全自動(dòng)還原糖測定儀,山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;紫外分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司。ARTP-Ⅱ誘變育種儀,無錫源清天木生物科技有限公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 選育流程

    原始菌株→種子液→稀釋→ARTP誘變→平板初篩→搖瓶復(fù)篩。

    1.2.2 篩選方法

    1) 初篩:將種子液用生理鹽水稀釋108倍并涂布于分離平板,涂布后的分離平板置于32 ℃條件下遮光培養(yǎng)2~3 d,挑選菌落直徑大,顏色深,菌苔較厚的單菌落作為復(fù)篩出發(fā)菌株。

    2) 復(fù)篩:搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。

    3) 遺傳穩(wěn)定性篩選:根據(jù)復(fù)篩結(jié)果挑選出較優(yōu)菌株,經(jīng)過5 次連續(xù)傳代,挑取核黃素生產(chǎn)能力高、遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。

    1.2.3 ARTP誘變方法

    將種子液OD600值調(diào)節(jié)至0.8左右,均勻涂布于載片表面,干燥后待用。誘變儀工作條件:注入氣體為氦氣,電源功率200 W,氣流量10 L/min,照射距離2 mm,樣品量10 μL。處理時(shí)間依次為0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,240 s。將處理后的載片置于裝有1 mL生理鹽水的EP管以溶出菌體,再取0.1 mL涂布至分離平板,培養(yǎng)后觀察并記錄菌落數(shù),采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率,并計(jì)算正突變率,即

    1.2.4 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

    種子培養(yǎng):挑取活化的單菌落接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,200 r/min、37 ℃培養(yǎng)20 h。

    搖瓶發(fā)酵:按5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,200 r/min、37 ℃培養(yǎng)84 h,定時(shí)取樣測定葡萄糖質(zhì)量濃度、核黃素質(zhì)量濃度、生物量等數(shù)據(jù)。

    5 L罐發(fā)酵:接種量5%,起始裝液量50%。控制通氣量1 m3/min,溶氧40%~60%,pH 6.4~6.6,37 ℃培養(yǎng)84 h,發(fā)酵過程中通過補(bǔ)料控制還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%~1.0%。定時(shí)取樣測定葡萄糖質(zhì)量濃度、核黃素質(zhì)量濃度、生物量等數(shù)據(jù)。

    1.2.5 相關(guān)測定方法

    1) 還原糖測定

    取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP管,10 000 r/min離心3 min,取上清液,使用SGD-4全自動(dòng)還原糖測定儀測定還原糖[13]。

    2) 生物量測定

    采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液中的生物量。

    3) 核黃素含量測定

    取發(fā)酵液1 mL于100 mL燒杯,加入2 mL冰醋酸和20 mL水,加熱煮沸5 min,加適量水,冷卻后移入250 mL容量瓶并定容。搖勻后過濾,取濾液用分光光度計(jì)于444 nm條件下比色測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算核黃素含量。

    4) 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    準(zhǔn)確稱取100 mg核黃素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL燒杯,加入5 mL冰醋酸和20 mL水,緩慢加熱使之完全溶解,用水稀釋至5,10,15,20,25 mg/L,波長444 nm下測定吸光值。以核黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),線性回歸后求得核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    對(duì)核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的核黃素質(zhì)量濃度x與吸光度y之間的線性回歸方程為

    y=0.031x+0.009

    相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4,說明在5~25 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

    圖1 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of riboflavin by spectrophotometry

    2.2 ARTP誘變時(shí)間對(duì)致死率及正突變率的影響

    按1.2.3方法對(duì)QJVB-1菌株進(jìn)行誘變,計(jì)算致死率及正突變率,獲得致死率及正突變率曲線,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 ARTP處理時(shí)間與致死率及正突變率的關(guān)系Fig.2 The relationship between ARTP treatment time and the lethal rate/ positive mutation rate

    由圖2可知:在實(shí)驗(yàn)條件下,隨著誘變時(shí)間延長,菌體致死率明顯增加,當(dāng)誘變時(shí)間超過160 s,致死率上升至90%以上。在20~140 s處理時(shí)間范圍內(nèi),正突變率從2%升至最高值8.1%,處理時(shí)間大于140 s后正突變率逐漸下降。為提高獲得高產(chǎn)菌株概率,確定140 s為最佳誘變時(shí)間,此時(shí)致死率和正突變率分別為88.1%和8.1%。

    2.3 篩選核黃素高產(chǎn)突變株

    菌落形態(tài)與核黃素產(chǎn)量存在相關(guān)性:顏色深、直徑大、菌苔厚的菌落對(duì)應(yīng)的突變株,其核黃素合成能力強(qiáng)[14-15]。通過觀察菌落形態(tài),從20 個(gè)分離平板共計(jì)677 個(gè)菌落中初篩出100 個(gè)單菌落,搖瓶復(fù)篩后挑選出4 株發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高15%以上的菌株,其搖瓶發(fā)酵水平如圖3所示。

    圖3 誘變菌株與出發(fā)菌株的核黃素產(chǎn)量比較Fig.3 The comparison of the mutant strains and the parent strain on riboflavin production

    2.4 遺傳穩(wěn)定性分析

    遺傳穩(wěn)定性是工業(yè)菌株的必備特性之一。實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)篩得到的4 株突變株進(jìn)行5 次連續(xù)傳代,測定每次傳代后的核黃素?fù)u瓶發(fā)酵水平,以此考察突變株的遺傳穩(wěn)定性,結(jié)果如表1所示。

    表1 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性Table 1 The genetic stability of mutant strains

    由表1可知:隨著傳代次數(shù)增加,突變株QJVB-2-16與QJVB-2-49的發(fā)酵終產(chǎn)物中核黃素質(zhì)量濃度逐漸降低,遺傳穩(wěn)定性差;突變株QJVB-2-72與QJVB-2-91隨著傳代次數(shù)增加,發(fā)酵液中核黃素質(zhì)量濃度未下降,具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

    2.5 突變菌株與出發(fā)菌株的發(fā)酵曲線

    根據(jù)2.4結(jié)果,挑選誘變株QJVB-2-72與QJVB-2-91進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,測定核黃素累積,比較3 株菌的發(fā)酵曲線,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 突變菌株與出發(fā)菌株的核黃 素累積曲線Fig.4 The riboflavin accumulation profile of the mutant and parent strains

    由圖4可知:與出發(fā)菌株相比,突變株QJVB-2-72與QJVB-2-91均表現(xiàn)出更強(qiáng)的核黃素合成能力,發(fā)酵72 h核黃素質(zhì)量濃度分別達(dá)到9 361 mg/L和9 447 mg/L,較出發(fā)菌株分別提高15.6%和16.8%。其中突變株QJVB-2-91發(fā)酵66 h即達(dá)到最大濃度,發(fā)酵周期縮短6 h。進(jìn)一步比較突變株QJVB-2-91和出發(fā)菌株QJVB-1生物量及糖耗曲線,結(jié)果如圖5所示。

    圖5 突變株和出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵的生物量及糖耗比較Fig.5 The comparison of the biomass and sugar consumption between the mutant strains and the parent strain in flask fermentation

    由圖5可知:與出發(fā)菌株相比,突變株QJVB-2-91在60 h前表現(xiàn)出更強(qiáng)的糖耗能力,生物量迅速增加,42 h達(dá)到最大生物量,較出發(fā)菌株提早6 h。60 h后,突變株糖耗能力逐漸降低,與圖4體現(xiàn)的發(fā)酵周期縮短、更強(qiáng)的核黃素合成能力相吻合。

    2.6 突變株QJVB-2-91在5 L罐上的發(fā)酵曲線

    利用5 L罐發(fā)酵比較突變株QJVB-2-91與出發(fā)菌株的發(fā)酵曲線,結(jié)果如圖6所示。

    圖6 5 L罐中的核黃素發(fā)酵過程曲線Fig.6 The riboflavin fermentation profile in fermenter(5 L)

    由圖6可知:突變株QJVB-2-91與出發(fā)菌株在5 L罐發(fā)酵過程中體現(xiàn)出的差異與搖瓶發(fā)酵相似。出發(fā)菌株的核黃素合成能力在整體過程中比較平穩(wěn),發(fā)酵液中核黃素濃度在72 h出現(xiàn)最高點(diǎn),產(chǎn)量19 060 mg/L;突變株QJVB-2-91的核黃素累積速度較快,發(fā)酵66 h達(dá)到最高值,產(chǎn)量22 001 mg/L,較出發(fā)菌株提高15.4%。分析生物量可知:兩菌的最大生物量基本相同,但突變株生長速度更快,在發(fā)酵36 h時(shí)達(dá)到最高值,比出發(fā)菌株提早6 h,且細(xì)胞死亡速度比出發(fā)菌株緩慢。

    3 結(jié) 論

    對(duì)核黃素生產(chǎn)菌QJVB-1進(jìn)行了ARTP誘變,通過初篩和復(fù)篩,得到QJVB-2-91突變株,其核黃素生產(chǎn)能力提高至9 447 mg/L,較出發(fā)菌株的8 087 mg/L提高16.8%,且發(fā)酵周期縮短6 h。該突變株經(jīng)過5次連續(xù)傳代,遺傳性狀穩(wěn)定。通過5 L罐發(fā)酵驗(yàn)證了突變株QJVB-2-91核黃素合成能力:發(fā)酵66 h核黃素累積質(zhì)量濃度達(dá)到22 001 mg/L,較出發(fā)菌株最高累積質(zhì)量濃度19 060 mg/L(72 h)提高15.4%,發(fā)酵周期縮短6 h。研究對(duì)核黃素生產(chǎn)成本的降低和產(chǎn)能的提高具有一定的意義。

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