基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

范夢夢　范儀銘　李峰　郭珈宜

【摘 要】目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎有效成分的作用靶點(diǎn)及通路。方法：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘牛膝的有效成分并預(yù)測其作用靶點(diǎn)，利用GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫篩選骨關(guān)節(jié)炎的靶標(biāo)，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物功能注釋及通路進(jìn)行分析。結(jié)果：預(yù)測得到20個(gè)牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎的有效成分和47個(gè)有效靶點(diǎn)，并推測其作用機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡信號通路、多種物種-細(xì)胞凋亡信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素-17信號通路等有關(guān)，且前列腺素G/H合成酶1、雄激素受體、雌激素受體1 等靶點(diǎn)基因可能起關(guān)鍵性作用。結(jié)論：牛膝有效成分可能通過調(diào)控炎癥因子及細(xì)胞凋亡等藥理作用發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;牛膝;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點(diǎn)

【ABSTRACT】Objective：To explore the target and pathway of active ingredients from Niuxi（Radix Achyranthis Bidentatae）for osteoarthritis by network pharmacology.Methods：TCMSP database was used to mine the effective components of Niuxi and predict their target.Databases such as Genecards and OMIM were used to screen the targets of osteoarthritis.The relationship network of drug，active components and target was constructed by using software Cytoscape .The interaction network of target protein was constructed by STRING database.The biological function annotation and pathway of key targets were analyzed.Results：Twenty active components and 47 effective targets of Niuxi for osteoarthritis were predicted，and the mechanism of action might be related to apoptosis signaling pathway，multi species apoptosis signaling pathway，tumor necrosis factor signaling pathway，interleukin-17 signaling pathway，and prostaglandin G/H synthetase 1，androgen receptor，estrogen receptor 1and other target genes may play a key role.Conclusion：The effective components of Niuxi may play a role in the treatment of osteoarthritis by regulating inflammatory factors and apoptosis.

【Keywords】 osteoarthritis;Niuxi;network pharmacology;target

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床常見的好發(fā)于中老年群體的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，病理表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)軟骨退變損傷、骨贅形成、滑膜炎癥性反應(yīng)、關(guān)節(jié)間隙變窄及軟骨細(xì)胞凋亡。OA發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，其病因涉及多種因素，如年齡、激素、肥胖、遺傳、工作性質(zhì)等[1]。目前，65歲以上人群約一半飽受OA的困擾，致殘率可高達(dá)53%[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念最早于2017年由HOPKINS等提出，其通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從而全面認(rèn)識藥物活性成分與疾病之間的作用關(guān)系，為藥物研發(fā)提供創(chuàng)新性策略[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)理論辨證論治、整體觀及方劑的配伍原則相統(tǒng)一[4]。本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論指導(dǎo)下，研究牛膝治療OA的作用機(jī)制，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，旨在為OA的臨床治療及實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持。

1 方 法

1.1 牛膝活性成分的篩選 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php），對牛膝所含成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，通過評價(jià)藥物化學(xué)成分在體內(nèi)的過程，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，篩選牛膝的活性成分[5]。

1.2 相關(guān)作用靶點(diǎn)的獲取與收集 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的“靶點(diǎn)預(yù)測”功能，預(yù)測牛膝入血活性成分作用靶點(diǎn)，并利用perl語言（http：//www.perl.org/）校正預(yù)測靶點(diǎn)名稱。檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），收集與OA相關(guān)的靶點(diǎn)，合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索后獲取的數(shù)據(jù)，排重后利用R語言（https：//www.r-project.org/）將與牛膝有效成分相關(guān)的作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得牛膝治療OA的靶點(diǎn)，并制作韋恩圖。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.1軟件（http：//www.cytoscape.org）構(gòu)建牛膝活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（Node）代表藥物、有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn);邊（Edge）代表藥物-成分、成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-疾病的連接。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建展示了藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病之間的關(guān)系，深入解讀牛膝治療OA的作用機(jī)制。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建與分析 運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）預(yù)測蛋白質(zhì)間的相互作用。STRING數(shù)據(jù)庫采用不同方式獲取預(yù)測結(jié)果并進(jìn)行評分，分值越高，PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果的置信度越高。本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫的“Multiple Proteins”功能，并設(shè)定“物種”為人類（Homo Sapiens），將牛膝治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，設(shè)置分值 > 0.4，便可構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)生物功能注釋及通路分析 本研究運(yùn)用perl語言工具將牛膝治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為entrez ID，并以R語言為平臺(tái)，通過Bioconductor、ClusterProfiler等工具以P < 0.05為條件，進(jìn)行富集分析，并將富集結(jié)果可視化。Bioconductor是以R語言為平臺(tái)，并為高通量基因組數(shù)據(jù)提供多種分析和理解方法的分析工具，其提供了含人類在內(nèi)的19個(gè)物種的GO注釋信息[6]。ClusterProfiler也是基因數(shù)據(jù)分析的R語言工具，其利用Bioconductor提供的GO注釋信息和KEGG pathway數(shù)據(jù)庫（http：//rest.keggjp/link/hsa/pathway）進(jìn)行信號通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 牛膝活性成分的篩選 運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到牛膝有效成分176個(gè)，以O(shè)B ≥ 30%和DL ≥ 0.18為篩選條件，獲得牛膝的潛在活性成分20個(gè)。見表1。

2.2 牛膝入血活性成分治療OA的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)預(yù)測篩選最終得到牛膝入血活性成分的作用靶點(diǎn)100個(gè);通過GeneCards平臺(tái)和OMIM平臺(tái)收集OA相關(guān)靶點(diǎn)，合并去重后最終獲得疾病靶點(diǎn)1301個(gè)。運(yùn)用R語言“VennDiagram”程序包將牛膝和OA靶點(diǎn)取交集，最終得到47個(gè)交集靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。見圖1。

2.3 牛膝治療OA的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將牛膝活性成分及其治療OA的作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見圖2。圖中黃色點(diǎn)代表牛膝的藥物活性成分，綠色點(diǎn)代表牛膝治療OA的作用靶點(diǎn)，邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，圖中結(jié)果提示槲皮素（Quercetin）、黃芩素（Baicalein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、雄激素受體（AR）、雌激素受體1（ESR1）等是牛膝治療OA的關(guān)鍵成分或靶點(diǎn)。圖中同一靶點(diǎn)可對應(yīng)多個(gè)活性成分，說明牛膝治療OA發(fā)揮著多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢。

2.4 牛膝治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析 運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫，輸入牛膝入血活性成分治療OA的靶點(diǎn)，設(shè)定置信度評分> 0.4，并將游離于網(wǎng)絡(luò)之外的蛋白予以剔除，最終得到PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖3。

網(wǎng)絡(luò)中的“節(jié)點(diǎn)”代表靶點(diǎn)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接節(jié)點(diǎn)越多，說明該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。運(yùn)用R語言繪制網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的條形圖，見圖4。

結(jié)果表明，白細(xì)胞介素-6（IL-6）、CASP3、VEGFA、MAPK8、MYC等蛋白的鄰接基因較多，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中占有重要的核心地位。

2.5 生物功能及通路分析 運(yùn)用R語言對疾病與藥物靶點(diǎn)47個(gè)交集基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，牛膝治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)富集顯著表現(xiàn)的前10個(gè)生物學(xué)功能為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性（12個(gè)靶點(diǎn)），核受體活性（6個(gè)靶點(diǎn)），轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合（6個(gè)靶點(diǎn)），RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（7個(gè)靶點(diǎn)），類固醇激素受體活性（5個(gè)靶點(diǎn)），激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（5個(gè)靶點(diǎn)），轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合（4個(gè)靶點(diǎn)），半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程（3個(gè)靶點(diǎn)），E-box binding（4個(gè)靶點(diǎn)），組蛋白脫乙酰酶結(jié)合（5個(gè)靶點(diǎn)）。結(jié)果表明，牛膝有效成分能夠通過調(diào)控多種生物學(xué)途徑發(fā)揮治療OA的作用。見圖5。

KEGG通路富集得出104條結(jié)果，其中102條通路的P < 0.01。以P值和通路富集基因的數(shù)量作為篩選條件，取前20個(gè)通路進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，基因明顯富集在細(xì)胞凋亡信號通路、多種物種-細(xì)胞凋亡信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、IL-17信號通路、泌乳素信號通路等通路上，見圖6。

3 討 論

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。OA產(chǎn)生的病因外與風(fēng)、寒、濕邪侵襲，痹阻經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)行失常有關(guān);內(nèi)因?yàn)楦文I虧虛，筋骨失養(yǎng)。本虛標(biāo)實(shí)是導(dǎo)致OA產(chǎn)生的重要病機(jī)。在治療上以補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨、溫經(jīng)通絡(luò)為主，兼以祛風(fēng)散寒除濕。牛膝為四大懷藥之一，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)的作用，是臨床治療OA的常用中藥材。在中醫(yī)藥治療OA的相關(guān)文獻(xiàn)中，牛膝的使用頻次居第2位[7]。

本研究檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，得到20個(gè)牛膝的潛在活性成分，經(jīng)與OA疾病靶點(diǎn)對接，得到11個(gè)活性化學(xué)成分，且均有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道，分別為海棠果素E[8]、黃芩苷[9]、黃連堿[10]、黃連素[11]、漢黃芩素[12]、黃藤素[13]、山柰酚[14]、槲皮素[15]、β-谷甾醇[16]、谷甾醇[17]、豆甾烯醇[18]。藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中可看出，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇是牛膝治療OA的關(guān)鍵成分。其中，槲皮素又名槲皮黃素，是黃酮類化合物，其能夠抑制炎癥遞質(zhì)的釋放，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[19]，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，清除氧自由基，有效減少氧化應(yīng)激引起的各種不良反應(yīng)[20]。山柰酚能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路相關(guān)蛋白的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[21]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，在抗炎、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著重要作用，β-谷甾醇的攝入量與慢性病發(fā)生率有一定的關(guān)系[22]。

OA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，疾病的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)、激素水平、炎癥因子的大量釋放等因素密切相關(guān)。本研究共預(yù)測到47個(gè)牛膝治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，PTGS1、AR、ESR1是藥物-成分-靶點(diǎn)的核心靶點(diǎn)。PTGS又稱為環(huán)氧合酶（COX），其分為2個(gè)亞型，即COX-1和COX-2。有研究表明，自身免疫性疾病和炎癥性疾病與PTGS有密切的關(guān)系[23]。AR是主要存在于睪丸間質(zhì)和支持細(xì)胞內(nèi)的核受體，能有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)由血管緊張素Ⅱ引發(fā)的血管收縮，且與一氧化氮的生成有著密切關(guān)系[24]。ESR1信號通路介導(dǎo)能夠促使雌激素發(fā)揮作用，增加骨膜的骨形成，減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，抑制骨小梁和皮質(zhì)內(nèi)骨表面的骨吸收[25]。

本研究將檢索到的靶點(diǎn)運(yùn)用GO和KEGG富集化分析，得到與OA密切相關(guān)的通路，如細(xì)胞凋亡信號通路、多種物種-細(xì)胞凋亡信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。這些通路與OA的產(chǎn)生關(guān)系密切。

本研究結(jié)果表明，牛膝治療OA有著多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，對所預(yù)測出來的靶點(diǎn)及通路需要進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證。綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究牛膝治療OA的機(jī)制，闡述了多靶點(diǎn)和多成分之間錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究牛膝治療OA的臨床應(yīng)用及研究提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬玉環(huán)，鄭文偉，林平冬，等.骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變與炎癥的關(guān)系[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2015，4（8）：50-53.

[2] 蘭維婭，唐芳，馬武開，等.基于經(jīng)典Wnt/β-catein信號通路的中醫(yī)藥干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎的研究述評[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2018，7（3）：66-69.

[3] 吳丹，高耀，向歡，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的柴胡抗抑郁作用機(jī)制研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2018，53（2）：210-219.

[4] LM S，LF L，HX Z，et al.Network pharmacology-based study on intervention mechanism of Huanglian Jiedu decoction in the treatment of Alzheimer's disease[J].Acta Pharmaceutica Sinica，2017，52（8）：1268-1275.

[5] 郭璐，夏道宗，駱葉姣，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討土茯苓治療痛風(fēng)的作用機(jī)制[J].中草藥，2019，50（6）：1413-1418.

[6] 王玉濤，龐雪，李安舉.茵陳治療深靜脈血栓形成的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（12）：1464-1473.

[7] 李開言，張留記，屠萬倩，等.牛膝有效部位含藥血清聯(lián)用對損傷軟骨細(xì)胞的增效作用[J].中國老年學(xué)雜志，2019，39（9）：2203-2207.

[8] 馬濤，王琳，程桂芳，等.海棠果素（紅厚殼烯酮內(nèi)酯）類似物的合成及其初步抗炎活性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（10）：1265-1269.

[9] LIANG R，CHEN CH，AI XC，et al.Structural Origins of the Differential Antioxidative Activities between Baicalein and Baicalin[J].Chinese Journal of Magnetic Resonance，2010，27（1）：132-140.

[10] 張玲，熊維建，張?zhí)?黃連堿對慢性腎功能衰竭大鼠的治療作用及其機(jī)制研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2017，34（1）：30-33.

[11] 庾國楨，彭皓均，黃秀芳，等.黃連素對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞TLR4/NF-κB信號通路的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（24）：164-170.

[12] 任曉東，符偉，張曉蕓，等.天然產(chǎn)物漢黃芩素的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2011，20（9）：777-784.

[13] HU YJ，YU OY，DAI CM，et al.Site-selective binding of human serum albumin by palmatine：spectroscopic approach[J].Biomacromolecules，2010，11（1）：106-112.

[14] XU TF，SHAN H，HUANG QR，et al.Kaempferol attenuates liver fibrosis by inhibiting activin receptor-like kinase 5[J].J Cell Mol Med，2019，23（9）：6403-6410.

[15] RUIZ-MIYAZAWA KW，STAURENGO-FERRARI L，MIZOKAMI SS，et al.Quercetin inhibits gout arthritis in mice：induction of an opioid-dependent regulation of inflammasome[J].Inflammopharmacology，2017，25（5）：555-570.

[16] RAHIMIFAD M，MANAYI A，BAEERI M，et al.Investigation of β-sitosterol and prangol extracted from achillea tenoifolia along with whole root extract on isolated rat pancreatic islets[J].Iran J Pharm Res，2018，17（1）：317-325.

[17] DENG SS，WEI T，TAN KL，et al.Phytosterol content and the campesterol：sitosterol ratio influence cotton fiber?development：role of phytosterols in cell elongation[J].Sci China Life Sci，2016，59（2）：183-193.

[18] YADAV M，PARLE M，JINDAL DK，et al.Protective effects of stigmasterol against ketamine-induced psychotic symptoms：possible behavioral，biochemical and histopathological changes in mice[J].Pharmacol Rep，2018，70（3）：591-599.

[19] 朱玲玲，張洋，竇勤玲，等.槲皮素對U937細(xì)胞遷移和侵襲能力及MMP-2，MMP-9表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（16）：146-151.

[20] 超黃，黃慶華，尤荻，等.槲皮素在創(chuàng)傷性腦損傷治療中潛在分子機(jī)制和臨床應(yīng)用的可行性[J].中國組織工程研究，2019，23（23）：3760-3766.

[21] 周運(yùn)江，王虎，李麗，等.山柰酚對脂多糖誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（6）：702-707.

[22] 張忠泉，邢煜君，胡國強(qiáng)，等.β-谷甾醇誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2011，36（15）：2145-2148.

[23] ANYONA SB，HENGARTNER NW，RABALLAH E，et al.

Cyclooxygenase-2 haplotypes influence the longitudinal risk of malaria and severe malarial anemia in Kenyan children from a holoendemic transmission region[J].J Hum Genet，2019，10（11）：1-13.

[24] YASUMASA I，KEN-ICHI A，SUMIKO Y，et al.Androgen-androgen receptor system protects against angiotensin Ⅱ-Induced vascular remodeling[J].Endocrinology，2009，150（6）：2857-2864.

[25] SCALCO RC，TRARBACH EB，ALBUQUERQUE EVA，et al.ESR1 polymorphism（rs2234693）influences femoral bone mass in patients with Turner syndrome[J].Endocr Connect，2019，8（11）：1513-1519.

收稿日期：2020-01-29;修回日期：2020-03-29