貫筋藤提取物對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

劉威良，姬昱，皮渤淼，蘇慧敏，吳白芬，黃艾祥

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

常規(guī)的免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺等化學(xué)藥物在器官移植閾自身免疫系統(tǒng)疾病治療方面發(fā)揮著重要作用，但這類藥物毒副作用大、依賴性強(qiáng)等缺點(diǎn)限制其在臨床上的應(yīng)用[1].研究發(fā)現(xiàn)，某些植物提取物是天然的免疫抑制劑且毒副作用弱、無依賴性等優(yōu)點(diǎn)深受廣大科研工作者的青睞.

貫筋藤(DregeasinensisHemsl.var.corrugataTsiang etp.t.)為蘿藦科(Asclepiadaceae)南山藤(DregeaE.Mey)屬植物苦繩(DregeasinensisHemsl)的一個(gè)變種，俗稱“奶漿藤”，主產(chǎn)云南大理、麗江、昆明等地，廣西、貴州也有分布，生長在海拔500～3 000 m的山地森林或灌木叢中[2-3].貫筋藤渾身是寶，其各個(gè)器官用熱水蒸煮浸泡后的溶液，可用來制作云南大理一種特色小吃“乳扇”，其鮮葉、花蕾可與辣椒面、豆豉等風(fēng)味調(diào)料一起搭配烹飪食之.貫筋藤的干莖是我國傣族醫(yī)藥(傣百解膠囊)的一味藥材，用于治療癰瘡癤腫，風(fēng)濕弊痛，咳嗽痰喘等病癥[4].古代一些醫(yī)藥專著也記載貫筋藤可祛風(fēng)濕止痛、平喘止咳、通經(jīng)下乳，用以醫(yī)治風(fēng)濕痹痛、肺熱咳喘、跌打損傷等病癥.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明貫筋藤富含黃酮、多糖、甾體皂苷及蛋白質(zhì)等活性成分，具有抗癲癇、抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病、抗寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[5-6].

目前關(guān)于貫筋藤的研究主要集中在貫筋藤蛋白酶和小分子功能物質(zhì)方面，如黃艾祥課題組對(duì)貫筋藤蛋白酶進(jìn)行了相關(guān)研究[7-8]，中科院昆明植物研究所對(duì)貫筋藤中的小分子活性物質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定[9].關(guān)于貫筋藤對(duì)體內(nèi)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答影響的報(bào)道頗少.貫筋藤經(jīng)水泡提取具有凝乳活性的物質(zhì)后直接丟掉造成資源的浪費(fèi)，本文以貫筋藤干莖和經(jīng)水提凝乳蛋白酶后的料渣作為試驗(yàn)對(duì)象，推測其在體內(nèi)可能發(fā)揮免疫抑制作用，建立了二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene，DNFB)誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)模型[10]，探究其醇提物對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響并初步探討了其可能的作用機(jī)制，為貫筋藤保健食品及藥品開發(fā)提科學(xué)依據(jù).目前貫筋藤提取物主要作為一種天然凝乳劑應(yīng)用于食品工業(yè)，其提取凝乳活性物質(zhì)后剩余殘?jiān)院休^多生物活性成分及營養(yǎng)物質(zhì)，隨著政府部門極力倡導(dǎo)節(jié)能減排，作為科研工作者的我們?nèi)绾胃咝А⒑侠砝盟幵哂兄匾默F(xiàn)實(shí)意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 貫筋藤鮮莖采自云南大理州劍川縣，海拔2 000～3 000 m山地森林或灌木叢中.

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量(18～22 g)，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(滇)K2013-0004].

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑 醋酸潑尼松(批號(hào)：20170518)，浙江仙琚制藥股份有限公司；2,4-二硝基氟苯(DNFB)(批號(hào)：20170916)；無水乙醇(分析純，批號(hào)：20171025)，天津市風(fēng)船化工股份有限公司；丙酮(批號(hào)：20170801)，天津市風(fēng)船化工股份有限公司；橄欖油(批號(hào)：20180520)，上?；瘜W(xué)試劑公司；血清干擾素-γ(IFN-γ)小鼠ELISA試劑盒(批號(hào):20180410)，武漢華聯(lián)生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉(批號(hào)：F20170909)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2.2 儀器與設(shè)備 400 Y多功能粉碎機(jī)(永康市鉑毆五金制品有限公司)；Scientz-500 C多功能恒溫超聲萃取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RE520旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)； TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Thermo1500全波長酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)； HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；直徑8 mm打孔器(湖北醫(yī)療器械一廠).

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備[7,11]貫筋藤及料渣醇提物：稱取1 kg貫筋藤干莖，粉碎，加入70%乙醇，料液比為1∶10，超聲提取(功率600 W，25 ℃，工作間歇比2 s/2 s)30 min，用紗布過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無醇味，真空冷凍干燥備用；稱取1 kg貫筋藤干莖，洗滌敲斷20倍水浸泡(60 ℃，30 min)提酶后得料渣，放烘箱50 ℃烘干后同法制備料渣醇提物.以上所得醇提物均濃縮至相當(dāng)于原生藥量1 g/mL的藥液，臨用時(shí)用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成懸浮液.

1.3.2 小鼠DTH模型的建立[12-13]試驗(yàn)第1天(誘導(dǎo)期)，將各組小鼠腹部固定部位用剃須刀剪短，然后用脫毛膏去毛，面積為3 cm×3 cm，局部均勻涂抹1% DNFB的丙酮-橄欖油溶液(1∶1)100 μL，空白組涂抹等量的不含DNFB的丙酮-橄欖油溶液.第2天同樣方法致敏1次，第6天(激發(fā)期)將1%DNFB的丙酮-橄欖油溶液(1∶1)20 μL，均勻涂于小鼠右耳廓進(jìn)行激發(fā)，左耳涂等量的丙酮-橄欖油溶液(1∶1)作對(duì)照，空白組左右耳涂抹等量的不含DNFB的丙酮-橄欖油溶液.

1.3.3 小鼠免疫抑制模型的建立 參考文獻(xiàn)方法并改進(jìn)，采用醋酸潑尼松(10 mg/kg)連續(xù)灌胃給藥，致使小鼠免疫器官(胸腺和脾臟)萎縮，建立小鼠免疫抑制模型.連續(xù)給藥數(shù)天后，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)，與空白組比較，經(jīng)潑尼松處理組小鼠免疫器官指數(shù)有明顯降低趨勢且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，此時(shí)表明造模成功[14].

1.3.4 動(dòng)物分組及處理 按照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》劑量選擇的方法，將人用劑量折算成小鼠給藥劑量，將84只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成7組，確保組間體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)，每組12只，即空白組、DTH模型組、潑尼松組、貫筋藤醇提物組、貫筋藤料渣醇提物組、貫筋藤醇提物+潑尼松組、貫筋藤料渣醇提物+潑尼松組.各組均灌胃給藥，給藥組給予相應(yīng)藥物(生藥量)2 g/kg，醋酸潑尼松10 mg/kg，空白和模型組給予同等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液.自致敏前1 d開始，連續(xù)給藥6 d，至末次給藥后30 min，開始激發(fā)，24 h后摘眼球取血后脫頸椎處死小鼠，剪下兩耳，同時(shí)取胸腺和脾臟；小鼠眼球取血后離心取上清，按照IFN- ELISA試劑盒說明書進(jìn)行含量檢測.為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗(yàn)均采用平行操作.

1.3.5 耳廓腫脹度的檢測 將各組小鼠左右耳廓用直徑8 mm打孔器同部位等面積切下耳片，稱質(zhì)量，計(jì)算腫脹度[15]：

耳廓腫脹度(mg)=右耳質(zhì)量(mg)-左耳質(zhì)量(mg)

耳廓腫脹抑制率(%)=

為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗(yàn)均采用平行操作.

1.3.6 臟器指數(shù)的測定 將各組小鼠剖下的脾臟和胸腺用生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分，稱質(zhì)量并計(jì)算[16-17]：

為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗(yàn)均采用平行操作.

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 貫筋藤提取物對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型小鼠耳腫脹度的影響

本研究表明，與空白組比較，DTH模型、潑尼松、貫筋藤醇提物、貫筋藤料渣醇提物、貫筋藤醇提物+潑尼松及貫筋藤料渣醇提物+潑尼松組小鼠耳廓腫脹度有明顯升高趨勢且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，同時(shí)亦說明小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型復(fù)制成功；與DTH模型組比較，潑尼松組和正常免疫組小鼠耳廓腫脹度明顯抑制(P<0.05或P<0.01)，貫筋藤醇提物+潑尼松及貫筋藤料渣醇提物+潑尼松組小鼠的耳廓腫脹度亦明顯減輕且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與潑尼松組比較，免疫抑制組小鼠耳廓腫脹度有明顯減輕的作用趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).由上述可知貫筋藤提取物對(duì)正常免疫小鼠有一定的免疫抑制作用，免疫抑制小鼠經(jīng)貫筋藤提取物干預(yù)后，耳廓腫脹度得到有效緩解，但相比空白還是有所差異，表明其與陽性藥醋酸潑尼松有一定的協(xié)同作用，結(jié)果見表1.

2.2 貫筋藤提取物對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型小鼠免疫器官質(zhì)量的影響

本研究顯示，與空白組比較，DTH模型組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)無顯著性變化(P>0.05)，潑尼松、貫筋藤醇提物+潑尼松及貫筋藤料渣醇提物+潑尼松組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，同時(shí)亦說明小鼠免疫抑制模型建立成功；與DTH模型組比較，潑尼松、貫筋藤醇提物+潑尼松及貫筋藤料渣醇提物+潑尼松組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)，正常免疫小鼠無顯著性變化(P>0.05)；與潑尼松組比較，免疫抑制小鼠胸腺和脾臟指數(shù)無顯著性差異(P>0.05).由此可知小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的降低主要是由于潑尼松引起的，同時(shí)亦表明小鼠免疫抑制模型復(fù)制成功，經(jīng)貫筋藤提取物干預(yù)后小鼠胸腺和脾臟指數(shù)未發(fā)生差異性變化，其發(fā)揮免疫抑制作用機(jī)理與醋酸潑尼松有所不同，有待進(jìn)一步考察，結(jié)果見表2.

與空白組比較，aP<0.05，AP<0.01；與DTH模型組比較，bP<0.05，BP<0.01

Compared with control group “a”indicate the significant differences(P<0.05)，“A”indicate the significant differences(P<0.01)；Compared with DTH model group“b” indicate the significant differences(P<0.05)，“B” indicate the significant differences(P<0.01).

組別Group數(shù)量/只Number劑量/kgDose胸腺指數(shù)/(mg·g-1)Thymus index(脾臟指數(shù)/(mg·g-1)Spleen index空白 Control1220 mL44.01±9.3146.10±6.59DTH模型 DTH Model 1220 mL44.88±7.6754.14±14.92潑尼松 Prednisonel1210 mg15.94±5.04AB29.38±6.04AB貫筋藤醇提物Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl122 g39.83±6.0956.43±9.55貫筋藤料渣醇提物Ethanol extrat of residue of Dregea sinensis Hemsl122 g44.00±7.1455.34±5.79貫筋藤醇提物+潑尼松Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg10.19±3.89BA24.52±6.37BA貫筋藤料渣醇提物+潑尼松Ethanol extrat of residue of Dregea sinensisHemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg15.58±12.53BA27.02±4.41BA

與空白組比較，aP<0.05，AP<0.01；與DTH模型組比較，bP<0.05，BP<0.01.

Compared with control group “a”indicate the significant differences(P<0.05)，“A”indicate the significant differences(P<0.01)；Compared with DTH model group“b” indicate the significant differences(P<0.05)，“B” indicate the significant differences(P<0.01).

2.3 貫筋藤提取物對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型小鼠血清IFN-γ的影響

本研究表明，與空白組比較，DTH模型組小鼠血清IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)；與DTH模型組相比，潑尼松、貫筋藤醇提物+潑尼松及貫筋藤料渣醇提物+潑尼松組小鼠血清IFN-γ顯著降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，正常免疫小鼠血清IFN-γ明顯降低(P<0.05)；與潑尼松組比較，免疫抑制小鼠呈現(xiàn)降低趨勢，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).由此可知，貫筋藤提取物發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)理可能與通過降低細(xì)胞炎性因子血清IFN-γ含量有關(guān)，免疫抑制組小鼠經(jīng)貫筋藤干預(yù)后，與潑尼松組比較，血清IFN-γ含量呈現(xiàn)降低趨勢，表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用，結(jié)果見表3.

組別Group數(shù)量/只Number劑量/kgDoseIFN-γ/(μg·mL-1)Interleukin gamma空白 Control1220 mL161.94±14.67bDTH模型 DTH Model1220 mL179.39±16.03a潑尼松 Prednisonel1210 mg162.02±11.2b貫筋藤醇提物 Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl122 g156.31±33.26b貫筋藤料渣醇提物Ethanol extrat of residue of Dregea sinensis Hemsl122 g149.81±35.88b貫筋藤醇提物+潑尼松Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg160.04±29.46b貫筋藤料渣醇提物+潑尼松Ethanol extrat of residue of Dregea sinensis Hemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg153.95±30.22b

與空白組比較，aP<0.05，AP<0.01；與DTH模型組比較，bP<0.05，BP<0.01.

Compared with control group “a”indicate the significant differences(P<0.05)，“A”indicate the significant differences(P<0.01)；Compared with DTH model group“b” indicate the significant differences(P<0.05)，“B” indicate the significant differences(P<0.01).

3 討論

DTH是由特異性致敏T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，T細(xì)胞在自身免疫、腫瘤免疫、移植物排斥反應(yīng)等方面起著重要作[18].DNFB是一種半抗原，將其稀釋液涂抹于腹壁皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T細(xì)胞增殖活化為致敏T細(xì)胞，經(jīng)過抗原提呈細(xì)胞作用效應(yīng)T細(xì)胞后，釋放一些細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等，產(chǎn)生炎性細(xì)胞浸潤為主的細(xì)胞免疫損傷效應(yīng)[19].研究表明，DNFB誘導(dǎo)的DTH模型是一種免疫性模型，對(duì)T細(xì)胞在炎癥免疫性疾病的研究中有一定指導(dǎo)意義.研究發(fā)現(xiàn)[20]，環(huán)磷酰胺和醋酸潑尼松這2種化學(xué)藥物均可用小鼠免疫抑制模型的建立，在所建立的免疫抑制模型中，各指標(biāo)對(duì)兩種藥物的敏感性有所差異，前者對(duì)免疫系統(tǒng)的影響較為復(fù)雜，并非單純的抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果更依賴于檢測時(shí)限和給藥劑量的選擇.有學(xué)者還指出[21]，醋酸潑尼松、地塞米松等糖皮質(zhì)類激素藥物與環(huán)磷酰胺相比，前者偏向于抑制細(xì)胞免疫，后者利于體液免疫抑制模型的建立.考慮試驗(yàn)免疫模型的建立應(yīng)根據(jù)需要選擇合適的造模劑，醋酸潑尼松成本相對(duì)較低、免疫抑制模型建立操作簡便，本研究采用醋酸潑尼松連續(xù)灌胃小鼠復(fù)制小鼠免疫抑制模型，通過計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)，與空白組相比，潑尼松組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)顯著降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，則認(rèn)為模型建立成功.

本研究以DNFB誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，采用醋酸潑尼松連續(xù)灌胃小鼠建立免疫抑制模型，由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，與空白比較，潑尼松組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著減低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，DTH模型組小鼠耳廓腫脹度明顯升高，且有顯著性差異(P<0.01)，表明小鼠免疫抑制模型與DTH模型復(fù)制成功.在動(dòng)物模型建立成功的基礎(chǔ)上，初步探討貫筋藤提取物對(duì)DTH的影響及作用機(jī)制，試驗(yàn)結(jié)果顯示，貫筋藤提取物使正常免疫小鼠的耳廓腫脹度明顯減輕(P<0.01)，醋酸潑尼松抑制了小鼠的細(xì)胞免疫功能，致使DNFB很難誘發(fā)出小鼠耳廓的腫脹，經(jīng)貫筋藤提取物干預(yù)后，各組小鼠耳廓腫脹度有減輕趨勢，表明它具有協(xié)同免疫抑制劑的作用.

在機(jī)體中，胸腺是重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化、發(fā)育的場所，主要參與細(xì)胞免疫；脾臟是產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的場所，其中大量的T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞在機(jī)體防御和清除功能中發(fā)揮重要作用[22-23].因此胸腺和脾臟指數(shù)是2個(gè)衡量模型動(dòng)物體內(nèi)免疫水平的關(guān)鍵指標(biāo).研究表明，醋酸潑尼可通過使脾臟和胸腺出現(xiàn)不同程度的萎縮達(dá)到細(xì)胞免疫抑制作用[24]，本研究中貫筋藤提取物對(duì)各組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)作用不明顯，則其發(fā)揮細(xì)胞免疫抑制作用的機(jī)制與潑尼松不同.另外，T細(xì)胞中的Th1亞群細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫是DTH的效應(yīng)細(xì)胞，在增強(qiáng)炎癥反應(yīng)中起重要作用，IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖和免疫性、提升有效的DTH反應(yīng)等方面[25].本試驗(yàn)結(jié)果顯示，貫筋藤提取物可明顯降低正常免疫小鼠血清IFN-γ的水平(P<0.05)，可能是其抑制DTH反應(yīng)的作用機(jī)制.考慮給藥劑量對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用具有雙向性，試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究.

貫筋藤作為一種藥食同源植物，其醇提物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫主要形式之一的DTH反應(yīng)有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與抑制DTH中Th1細(xì)胞IFN-γ的分泌水平有關(guān)，其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是其中一些小分物質(zhì)如黃酮、生物堿等，具體是哪類單體化合物起作用，有待進(jìn)一步考察.研究表明[26]，一些西藥類免疫抑制劑在發(fā)揮治療作用的同時(shí)也對(duì)肝臟、腎臟及神經(jīng)系統(tǒng)造成不同程度的損傷，然而一些植物提取物具有活性高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，其開發(fā)利用日益受到廣大學(xué)者青睞，可以推測其在體內(nèi)免疫抑制劑的應(yīng)用上有更值得深入研究的價(jià)值.

4 結(jié)論

綜述所述，本研究主要初步考察了貫筋藤粗提物對(duì)小鼠DTH反應(yīng)的影響(特異性免疫指標(biāo))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的貫筋藤提取物對(duì)正常免疫小鼠及免疫抑制小鼠均有一定的刺激作用，顯著降低DTH模型組小鼠耳廓腫脹度及血清IFN-γ的水平，發(fā)揮一定的免疫抑制作用且能與潑尼松有協(xié)同效果，但對(duì)中樞免疫器官(胸腺與脾臟)影響未見差異性變化，這表明其作用機(jī)制與潑尼松有所不同，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步考察.總之，試驗(yàn)研究可為以后保健食品及藥品的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐，也為貫筋藤料渣資源高效利用提供新的途徑.