基于R5 ELISA和RP-HPLC法的小麥發(fā)芽過程中主要致敏蛋白含量變化

胡慧敏，潘雪峰，楊恒，陳晨，陳銀基

基于R5 ELISA和RP-HPLC法的小麥發(fā)芽過程中主要致敏蛋白含量變化

胡慧敏，潘雪峰，楊恒，陳晨，陳銀基

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，南京 210023）

【目的】探索不同萌發(fā)狀態(tài)小麥麩質蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等主要致敏蛋白含量的動態(tài)變化規(guī)律，以及醇溶蛋白、谷蛋白亞基的含量變化，為無麩質食品的研發(fā)和發(fā)芽小麥的利用提供科學依據(jù)?！痉椒ā靠刂瓢l(fā)芽條件獲得7種不同萌發(fā)狀態(tài)的小麥，采用SDS-PAGE分析不同萌發(fā)狀態(tài)小麥醇溶蛋白（Gliadins）、谷蛋白（Glutenin）的亞基組成變化，通過R5 ELISA和RP-HPLC進一步測定小麥發(fā)芽過程中麩質蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白亞基的含量變化。【結果】以R5 ELISA法和RP-HPLC法兩種方法可有效測定小麥中麩質蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白亞基的含量，發(fā)芽處理對上述過敏蛋白及亞基有不同程度的影響；麩質蛋白含量在發(fā)芽初期變化不大，后期顯著減少；ω-醇溶蛋白相對含量變化不顯著；-/-醇溶蛋白的相對含量在發(fā)芽過程中大幅度降低（從未處理小麥籽粒的41.85%降低到發(fā)芽處理后的31.51%—35.35%，<0.01），-醇溶蛋白相對含量從31.37%顯著增加到發(fā)芽處理后的36.69%—39.02%（<0.05）；高分子量麥谷蛋白亞基（high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白亞基（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS）的相對含量變化不顯著，HMW-GS略有減少，從8.66%（未處理組）降低到5.94%（芽長1/4），再回升到7.28%（芽長=籽粒長）；LMW-GS略有增加，從8.30%（未處理組）增加到10.45%（芽長=籽粒長）?！窘Y論】R5 ELISA法和RP-HPLC法兩種方法都可以有效進行小麥致敏蛋白定量分析；發(fā)芽過程中小麥的致敏蛋白含量總體呈下降趨勢，特別是在發(fā)芽芽長達籽粒長1/2時，含有最多致敏肽的-/-醇溶蛋白下降尤為顯著，提示小麥進行適度發(fā)芽處理可以降低致敏性。

乳糜瀉；醇溶蛋白；谷蛋白；麩質蛋白；R5 ELISA；RP-HPLC

0 引言

【研究意義】乳糜瀉（Celiac disease）是由基因易感個體攝入小麥、黑麥和大麥中的麩質蛋白引起的T細胞介導的自身免疫病[1]。乳糜瀉不同于一般蛋白質過敏，一般蛋白質過敏不是自身免疫病，通常不會引起嚴重的腸道損傷或營養(yǎng)不良。乳糜瀉患者目前的治療方法是終生堅持嚴格的無麩質飲食。乳糜瀉的患病率約為0.5%—2%，在發(fā)達國家發(fā)生率較高，且在發(fā)展中國家呈快速增長趨勢[2-3]。麩質蛋白由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，約占小麥貯藏蛋白的80%，麥醇溶蛋白和麥谷蛋白參與面筋網(wǎng)絡的形成，影響面團的流變學特性。麥醇溶蛋白可分為-/-、-和-醇溶蛋白，分子量分布在30—60 kD[4]。麥谷蛋白按分子量大小可分為高分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS，80—130 kD）和低分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GS，30—70 kD）[5]。研究表明，麥醇溶蛋白中含有豐富的脯氨酸和谷氨酰胺，是麩質蛋白中最主要的抗原成分，能夠觸發(fā)免疫反應，其中包含刺激性表位最多的是-/-醇溶蛋白[6]。雖然小麥中的麩質蛋白是由基因決定的，但麩質蛋白的積累在很大程度上受環(huán)境的影響[7]。小麥收獲季節(jié)如遇到陰雨天氣，容易出現(xiàn)發(fā)芽現(xiàn)象，會給廣大農(nóng)民及食品加工企業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[8]。因此，研究小麥發(fā)芽過程中麩質蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白及其亞基的含量變化，有利于提高發(fā)芽小麥的應用潛力，提高其利用率和經(jīng)濟價值?！厩叭搜芯窟M展】董召榮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)芽程度加深，小麥籽粒蛋白質含量遞減，濕面筋含量逐漸降低。OLAERTS等[10]研究田間小麥收獲前發(fā)芽對蛋白質性質的影響，發(fā)現(xiàn)小麥發(fā)芽過程中LMW-GS含量增加?；赗5和G12抗體的酶聯(lián)免疫吸附法（R5 ELISA & G12 ELISA）是最常用的檢測食品中麩質蛋白的方法，因其特異性、敏感性和作為常規(guī)檢測的適應性，是國際食品法典委員會（CAC）官方認可的方法[11]。然而，由于食品中蛋白質及其他成分的復雜性和抗體的局限性，ELISA法可能會導致假陽性或陰性以及對實際刺激CD的T細胞表位的高估[12]。因此，有學者建立了基于蛋白質組學的方法如反相或凝膠滲透高效液相色譜（RP-HPLC & GP-HPLC）、質譜法和液相色譜法（LC-MS/MS）相結合的方法對麩質蛋白進行定量測定的非免疫學方法[13]?！颈狙芯壳腥朦c】研究表明，發(fā)芽會降低小麥籽粒蛋白質含量以及小麥粉的加工品質，但不同發(fā)芽狀態(tài)中小麥麩質蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白以及其亞基的含量變化未有過系統(tǒng)性分析。【擬解決的關鍵問題】研究不同萌芽狀態(tài)小麥麩質蛋白組分含量動態(tài)變化，并進一步探究其亞基組成和含量的動態(tài)變化規(guī)律，為無麩質食品的研發(fā)提供資料積累，為發(fā)芽小麥的利用提供新思路。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在南京財經(jīng)大學糧食儲運國家工程實驗室進行。

1.1 材料與試劑

小麥，品種：焦麥266，產(chǎn)于河南商丘。

乙醇、異丙醇、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）、丙酮、三氯乙酸，分析純；乙腈，三氟乙酸，色譜純；考馬斯亮藍R-250、5×蛋白上樣緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；Cocktail提取液，ELISA試劑盒，德國拜發(fā)公司。

1.2 儀器與設備

Mini-PROTEAN電泳儀，ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；SpectraMax 190酶標儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽小麥制備 取干凈托盤鋪上一層濾紙，小麥浸泡15 h后，平鋪在濾紙上，室溫下放于避風防曬處發(fā)芽，隔1—2 h噴一次水，保持小麥濕潤。分別選取未浸泡、浸泡15 h、露白、芽突破種皮、芽長1/4、芽長1/2和芽長等于籽粒的小麥，40℃下干燥，磨粉，過60目篩。

1.3.2 麥醇溶蛋白提取 稱取0.1 g小麥粉，加入1 mL蒸餾水，渦旋混勻，于50℃水浴中提取30 min,每隔5—210 min混勻一次，13 000 r/min離心10 min,重復提取2次，棄上清液；加入1 mL 0.5 mol·L-1NaCl溶液，50℃水浴中提取30 min，每隔5—10 min混勻一次，13 000 r/min離心10 min，重復提取兩次，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇溶液，50℃水浴中提取30 min，每隔5—10 min混勻1次，13 000 r/min離心10 min，重復提取2次，合并2次上清液，即為麥醇溶蛋白。

1.3.3 麥谷蛋白提取 除去醇溶蛋白后的沉淀加入1 mL提取液（50%異丙醇、80 mmol?L-1Tris-HCl、1% DTT，pH 8.0），65℃水浴中提取30 min，13 000 r/min離心10 min，重復提取2次，合并上清液即為麥谷蛋白。

1.3.4 SDS-PAGE 每個樣品加入4倍體積的100%丙酮，-20℃冷凍過夜。第2天取出樣品，升溫至4℃，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，空氣干燥沉淀。向沉淀中加入200 μL 1×蛋白上樣緩沖液，100℃加熱5 min，取5 μL上樣。參考SHETTY[14]的方法并適當修改進行蛋白質電泳，采用12%的分離膠和4%的濃縮膠，電泳條件為恒流電壓80 V。電泳結束后，用10%三氯乙酸溶液固定15 min，固定后用考馬斯亮藍R-250對蛋白進行染色過夜，脫色液脫色6 h，用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.3.5 R5 ELISA 稱取0.25 g小麥粉，加入2.5 mL Cocktail提取液，渦旋混勻，50℃條件下孵育40 min；加入7.5 mL 80%乙醇，室溫條件下回旋振蕩1 h，7 000 r/min離心10 min，收集上清液，稀釋5 000倍，取100 μL每孔進行檢測。檢測步驟如下：將100 μL標準品及樣品溶液加到微孔中，均做2個平行，在室溫條件下孵育30 min；倒出孔中液體，將微孔板倒置在吸水紙上拍打，完全除去孔中液體，每孔加入250 μL稀釋后的洗滌緩沖液洗滌微孔，以上操作重復進行2遍；每孔加入100 μL稀釋后的酶連接物溶液，室溫條件下孵育30 min，倒出孔中液體，每孔加入250 μL洗滌緩沖液洗滌微孔2遍；每孔加入50 μL底物和50 μL發(fā)色劑，室溫條件下暗處孵育30 min；每孔加入100 μL反應終止液，30 min內于450 nm處測量吸光度值。

1.3.6 RP-HPLC 所有樣品過0.45 μm濾膜后上樣，參考CHO等[15]的方法并適當修改進行RP-HPLC分析，分析條件如下：色譜柱：AcclaimTM120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：含0.1%三氟乙酸的水溶液；流動相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；進樣量：20 μL；流速：1 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：60℃；洗脫梯度：0—60 min流動相B從21%到48%，60—65 min流動相B從48%到21%，65—70 min流動相B為21%，70 min停止。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel整理數(shù)據(jù)，SPSS Statistics進行數(shù)據(jù)分析和OriginPro 8作圖。

2 結果

2.1 不同發(fā)芽狀態(tài)的小麥

選取小麥發(fā)芽的7個不同階段，如圖1所示。

2.2 不同發(fā)芽狀態(tài)小麥醇溶蛋白、谷蛋白SDS-PAGE分析

從圖2可以看出，醇溶蛋白亞基分子量主要集中在30—60 kD，但因-/-、-、-醇溶蛋白分子量較接近，無法完全區(qū)分開。從圖3可以看出谷蛋白被成功分離，主要分為兩個部分：高分子量谷蛋白亞基HMW-GS主要集中在80—140 kD，有5個條帶；低分子量谷蛋白亞基LMW-GS主要集中在30—50 kD，同樣有5個條帶。兩種蛋白質組分在小麥發(fā)芽過程中無顯著變化。

2.3 不同發(fā)芽狀態(tài)小麥麩質蛋白ELISA分析

R5 ELISA法測定小麥發(fā)芽過程中麩質蛋白含量變化如圖4所示?？梢钥闯觯l(fā)芽處理對小麥麩質蛋白含量有一定影響，從未浸泡到突破種皮的過程中，小麥麩質蛋白含量變化不顯著，到芽長1/4時含量明顯降低，從未浸泡小麥籽粒的17 800 mg·kg-1降低到17 165 mg·kg-1，芽長1/2時有所回升，到芽長=籽粒時又下降到最低水平17 043 mg·kg-1。

A-G分別為未浸泡、浸泡后、露白、突破種皮、芽長1/4、芽長1/2、芽長=籽粒。下同

圖2 不同發(fā)芽狀態(tài)小麥醇溶蛋白SDS-PAGE圖譜

2.4 不同發(fā)芽狀態(tài)小麥醇溶蛋白、谷蛋白RP-HPLC分析

不同發(fā)芽程度小麥醇溶蛋白、谷蛋白RP-HPLC圖譜如圖5所示，根據(jù)保留時間判斷各蛋白亞基的種類。ω-醇溶蛋白保留時間在25—34 min，-/-醇溶蛋白保留時間為35—45 min，-醇溶蛋白保留時間在46—56 min；HMW-GS保留時間在25—39 min，LMW-GS保留時間在40—54 min。根據(jù)RP-HPLC圖譜中單個蛋白質亞基的峰面積占所有蛋白質亞基總峰面積的百分比計算各蛋白質亞基的相對含量，即亞基相對含量（%）=（各亞基峰面積/總峰面積）×100[16]。

不同發(fā)芽狀態(tài)小麥醇溶蛋白和谷蛋白亞基的相對含量如表1所示。發(fā)芽處理對小麥醇溶蛋白、谷蛋白亞基的相對含量有不同程度的影響，-醇溶蛋白相對含量在發(fā)芽過程中變化不顯著（>0.05），基本維持在與未發(fā)芽小麥籽粒相同的水平；-/-醇溶蛋白相對含量變化差異極顯著（<0.01），在浸泡15 h后從41.85%急劇下降到33.81%，浸泡后到突破種皮的階段-/-醇溶蛋白相對含量緩慢回升，從33.81%增加到35.35%，之后又下降至31.51%；-醇溶蛋白相對含量變化差異顯著（<0.05），未浸泡到露白的過程中緩慢上升，從31.37%增加到39.02%，露白到芽長1/4過程變化不顯著，之后下降到36.91%。HMW-GS與LMW-GS的相對含量在小麥發(fā)芽過程中的變化不顯著（>0.05），其中HMW-GS相對含量在浸泡過程中變化較小，從浸泡到芽長1/4階段有所減少，從8.98%降低到5.94%，之后回升到8.00%，最后階段小幅減少，最終含量較原小麥籽粒低；LMW-GS相對含量在浸泡15 h后小幅增加，從浸泡后到突破種皮階段小幅降低，從9.80%下降到8.73%，之后回升到10.45%，發(fā)芽后期相對含量較原小麥籽粒有所增加。

圖3 不同發(fā)芽狀態(tài)小麥谷蛋白SDS-PAGE圖譜

不同小寫字母表示不同發(fā)芽程度小麥麩質蛋白含量的差異顯著（P<0.05）

表1 不同發(fā)芽狀態(tài)小麥中醇溶蛋白和谷蛋白相對含量（%）

表中小寫字母表示在0.05水平差異顯著，大寫字母表示在0.01水平差異顯著

The lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level, and the capital letters indicate significant differences at 0.01 level

圖5 不同發(fā)芽程度小麥醇溶蛋白、谷蛋白組成RP-HPLC圖譜

3 討論

麩質蛋白由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，約占小麥貯藏蛋白的80%，麥醇溶蛋白賦予面團延展性，麥谷蛋白賦予面團粘彈性，二者的組成和結構是決定面團形成及烘焙品質的重要因素[17]。小麥在發(fā)芽過程中呼吸作用增強，淀粉酶和蛋白酶活性也會增強，使蛋白質和淀粉發(fā)生水解，小麥粉的加工品質發(fā)生劣變，主要表現(xiàn)在面團的拉伸特性、粉質特性的下降[18-19]。對于小麥發(fā)芽過程中蛋白質的變化，前人多研究干、濕面筋含量的變化對小麥粉品質的影響，或其他功能性成分的含量變化，對組成面筋蛋白的醇溶蛋白、谷蛋白及其亞基的動態(tài)變化規(guī)律研究較少，且前人研究多以發(fā)芽時間為參照，研究發(fā)芽過程中蛋白質的變化，但小麥發(fā)芽過程受環(huán)境影響較大，僅以發(fā)芽時間為參照不能很好判斷具體發(fā)芽狀態(tài)。國家標準對生芽粒的定義為芽或幼根雖未突破種皮但胚部種皮已破裂或明顯隆起且與胚分離的顆粒，或芽或幼根突破種皮不超過本顆粒長度的顆粒[20]。

本研究結果表明小麥發(fā)芽后期，麩質蛋白含量降低，這與張佳靈[21]、菅桂玲[22]等研究發(fā)現(xiàn)小麥發(fā)芽過程中濕面筋、干面筋含量和面筋指數(shù)均降低的結果一致。小麥發(fā)芽過程中LMW-GS含量增加，而HMW-GS減少，這與OLAERTS[10]、BOUKID[23]等的研究結果一致。小麥發(fā)芽過程中醇溶蛋白含量大幅度降低，這與邱然等[24]研究大麥發(fā)芽過程中醇溶蛋白含量的變化結果一致。蛋白質含量減少是由于小麥發(fā)芽時，貯藏蛋白在蛋白酶的作用下降解，為種子萌發(fā)提供必要的物質和能量。醇溶蛋白與谷蛋白含量變化趨勢不同，說明蛋白酶在水解貯藏蛋白時具有一定的選擇性，且種子發(fā)芽時內部發(fā)生一系列復雜的變化，其中蛋白質既發(fā)生分解又出現(xiàn)合成，LMW-GS的增加或許是以HMW-GS的減少為代價。PRANDI[25]、BOUKID[26]等研究不同品種小麥模擬胃腸消化物中致乳糜瀉肽段肽的組成發(fā)現(xiàn)了13種-醇溶蛋白、3種-醇溶蛋白和1種低分子量麥谷蛋白。CICCOCIOPPO等[27]綜述的36種致乳糜瀉肽段包含21種-醇溶蛋白、10種麥谷蛋白和5種-醇溶蛋白?？梢?醇溶蛋白是引起乳糜瀉的最主要肽段，本試驗可明顯看出小麥發(fā)芽過程中-/-醇溶蛋白含量下降最為明顯，其原因可能與半胱氨酸蛋白酶對醇溶蛋白水解的特異性有關，半胱氨酸蛋白酶以不同的速度水解所有醇溶蛋白組分，部分醇溶蛋白具有優(yōu)先水解的可能性[28]。這一結果或可為無麩質食品的研發(fā)及發(fā)芽小麥的利用提供新的思路。

全球乳糜瀉總患病率約為1.4%[29]。在一項對1 339名美國青少年易感基因型的長期研究中發(fā)現(xiàn)乳糜瀉的發(fā)病率很高，平均發(fā)病率達到2.5%[30]。ABADIE等[31]發(fā)表了“乳糜瀉冰山”模型，目的是證明具有經(jīng)典乳糜瀉癥狀的患者僅僅是少數(shù)患者。我國乳糜瀉總發(fā)病率相比歐洲國家較低，但中國人口基數(shù)大，且有很多地區(qū)以小麥為主食，因此可能存在很多潛在乳糜瀉患者。一項對19 778名16—25歲中國年輕人的研究顯示，約2%的人血清乳糜瀉標志物檢測結果呈陽性[32]。因此，對于乳糜瀉展開相關研究具有十分重要的意義，歐美國家開展研究較早，且已取得階段性進展，而我國關于乳糜瀉的研究才剛剛起步。本試驗僅研究了小麥發(fā)芽過程中醇溶蛋白、谷蛋白亞基的相對含量變化，之后還需對致乳糜瀉肽段展開更深入的研究。

4 結論

不同發(fā)芽狀態(tài)小麥中麩質蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白及其亞基含量變化具有一定差異，麩質蛋白在發(fā)芽前期含量變化不大，到后期開始顯著減少。-/-醇溶蛋白的相對含量在發(fā)芽過程中有較大幅度降低，-醇溶蛋白相對含量無顯著變化，-醇溶蛋白相對含量顯著增加，HMW-GS和LMW-GS相對含量變化不顯著；與未處理小麥相比，HMW-GS減少，LMW-GS增加。綜上所述，適度發(fā)芽處理可降低小麥致敏肽含量。研究結果為低麩質食品的研發(fā)和發(fā)芽小麥的加工利用提供了科學依據(jù)。

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Wheat Gluten, Gliadins and Glutenin Content Changes during Germination Based on the Methods of R5 ELISA and RP-HPLC

HU HuiMin, PAN XueFeng, YANG Heng, CHEN Chen, CHEN YinJi

(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023)

【Objective】 The current study was conducted to determine the dynamic changes of gluten, gliadins and glutenin contents in different germination states of wheat, so as to provide a scientific basis for the development of gluten-free food and utilization of germinated wheat. 【Method】Seven wheat grains with different germination states were obtained by controlling the germination conditions. Changes of composition of gliadins and glutenin were analyzed by sodium dedecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and changes of gluten, gliadins and glutenin subunits during wheat germination were further determined by enzyme-linked immunosorbent assay based on R5 antibody (R5 ELISA) and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). 【Result】The content of gluten, gliadins and glutenin subunits in wheat could be determined by R5 ELISA and RP-HPLC. Germination treatment had different effects on the allergic proteins and subunits mentioned above. The content of gluten changed little at the early stage of germination, but decreased significantly at the later stage. The relative content of-gliadins did not change significantly. During the germination process, the relative content of-/-gliadins was significantly reduced, with the percentage of untreated wheat seeds decreased from 41.85% to 31.51%-35.35% after germination (<0.01). The relative content of-gliadins increased significantly from 31.37% to 36.69%-39.02% after germination (<0.05). The relative content changes of high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS) and low molecular weight glutenin subunit (LMW-GS) were not significant. HMW-GS decreased slightly from 8.66% (untreated group) to 5.94% (1/4 bud length) and then to 7.28% (bud length=grain length). LMW-GS increased slightly from 8.30% (untreated group) to 10.45% (bud length=grain length).【Conclusion】Both of the methods R5 ELISA and RP-HPLC could be used for quantitative analysis of wheat sensitized proteins. The content of allergenic protein in wheat decreased during germination. In particular, when the germinating bud was up to 1/2 long, the-/-gliadin which containing the most sensitive peptide decreased significantly. It was suggested that moderate germination treatment could reduce sensitization of wheat.

celiac disease; gliadin; glutenin; gluten; R5 ELISA; RP-HPLC

2019-07-30；

2019-10-30

國家自然科學基金面上項目（31871822）

胡慧敏，E-mail：1044647411@qq.com。通信作者陳銀基，E-mail：chenyinji@hotmail.com

（責任編輯 趙伶俐）