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    改良伸直位制動法建立兔膝骨關節(jié)炎模型的效果評價

    2020-04-12 05:34:14何業(yè)文張成芳黎建宇粟昌金戴林軍謝晨輝
    關鍵詞:管型繃帶造模

    何業(yè)文,范 磊,張 堃,張成芳,高 輝,黎建宇,粟昌金,戴林軍,謝晨輝

    (湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院放射科,湖南 長沙 410007)

    骨性關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是最常見的骨關節(jié)病,主要病因是軟骨退變[1]。相關研究[2]顯示,我國OA 的發(fā)病率約8.3%,65 歲以上人群放射學OA 的發(fā)病率高達50.0%。目前,OA 發(fā)病及治療干預機制的前期研究都依賴于動物實驗,因此,建立一種可行、可靠的動物模型對OA 的研究具有十分重要的意義。制動法OA 模型在模擬OA 病理生改變、藥物篩選、療效評價方面具有較大優(yōu)勢,但經(jīng)典的制動法存在造模時間長、制動管型易咬除脫落、并發(fā)癥較多等問題,因此本研究對伸直位制動法進行了改良,成功制備了兔膝關節(jié)OA 模型,現(xiàn)闡述如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 選擇新西蘭大白兔27 只(湖南中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供),體質量(2 035±167)g;雄性14 只,雌性13 只;適應性喂養(yǎng)1 周;隨機分為2組,A 組9 只,制動2 周;B 組18 只,制動6 周。本實驗經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院倫理委員會批準(倫理審查備案號2017-0021)。

    1.2 實驗器械 兔架、電子秤、醫(yī)用高分子固定繃帶(蘇州元康醫(yī)療器械有限公司)、壓舌板、繃帶、紗布、石膏剪、手術刀、手術剪、骨剪、鑷子和動物用去毛剪等。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 造模方法 ①造模前準備:將實驗兔斜俯臥位固定于實驗臺,向后上方拉直右下肢。去毛剪去毛,范圍為右側髖關節(jié)至踝關節(jié)。醫(yī)用碘伏消毒裸露皮膚,如有皮膚損傷,止血消毒后,用醫(yī)用紗布包扎。②造模:伸直右下肢膝關節(jié),同側踝關節(jié)保持正常生理曲度。用繃帶將壓舌板纏繞固定于右下肢內側,再用醫(yī)用膠帶加固,壓舌板上端距髖關節(jié)1~2 cm,下端超過踝關節(jié)。后依次纏繞多層紗布和4 層醫(yī)用高分子固定繃帶,高分子固定繃帶纏繞松緊適中,纏繞方式為重疊二分之一螺旋狀纏繞,纏繞區(qū)域為髖關節(jié)至踝關節(jié)以下4~5 cm,裸露遠端腳趾以便后續(xù)觀察。高分子固定繃帶管型在踝關節(jié)處呈“L”型,角度為120°~150°。姿勢固定4~5 min 以待管型定型。確定姿勢固定滿意、管型位置、形態(tài)符合要求、無其他損傷后,將實驗兔放回兔籠。一兔一籠,按照實驗兔標準喂養(yǎng),允許其在籠內自由活動和進食,飼養(yǎng)環(huán)境適宜。若管型脫落,立即重新固定;若管型過緊、遠端肢體淤血腫脹等,立即拆除管型,待患肢情況好轉后重新固定。

    1.3.2 造模效果評價 造模后2 周和6 周以空氣栓塞法分別處死A 組和B 組實驗兔。以前上方入路分別解剖右側制動膝關節(jié)和左側對照膝關節(jié),觀察膝關節(jié)有無感染、潰爛等情況,剔除周圍肌肉和韌帶等附屬組織,暴露股骨和脛骨平臺關節(jié)軟骨、半月板。大體觀察股骨內外側髁關節(jié)軟骨情況,并取股骨內側髁后部關節(jié)軟骨,以10%甲醛固定48 h,再脫水、包埋,切片后HE 染色觀察關節(jié)軟骨退變情況。

    1.3.3 造模并發(fā)癥評價 造模前記錄實驗兔體質量,每天觀察實驗兔肢端血液循環(huán)、近端皮膚磨損、姿勢、制動管型脫落和咬除等情況。每周測量一次體質量。若出現(xiàn)感染,可使用抗生素治療。

    1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示。對體質量等測定結果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,完全隨機設計多組比較用LSD 和Dunnett 法,不滿足方差分析條件時采用單因素非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis 檢驗)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 2 組一般情況評價 A 組造模前和處死前體質量分別為(1 932±91)、(1 623±213)g,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。B 組造模前和處死前體質量分別為(2 087±177)、(1 851±393)g,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    2.2 骨關節(jié)炎造模效果 實驗兔右膝關節(jié)姿勢固定滿意、制動效果良好,未出現(xiàn)制動管型被咬除、脫落情況,可自由移位和進食進水。

    大體病理所見股骨軟骨受損部位穩(wěn)定,位于股骨內外側髁后部,股骨內側髁軟骨病變中心距離內側骨緣5~7 mm。A 組右膝關節(jié)見關節(jié)囊增厚并關節(jié)滑膜充血,關節(jié)腔積液增多,股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨色澤暗淡不均且發(fā)紅,表面光整(圖1a);HE染色見軟骨表面局部不規(guī)則淺裂隙形成,軟骨細胞數(shù)量減少、局部成簇增生、結構紊亂,基質染色變淺,潮線完整(圖2a)。B 組右膝關節(jié)明顯僵直,關節(jié)滑膜增厚并部分填充到關節(jié)腔內,大部分關節(jié)腔積液增多、黏稠,少部分關節(jié)腔積液減少,股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨失去光澤、顏色不均、發(fā)紅,較2 周時更明顯,表面不光整,可見不同程度斑片狀關節(jié)軟骨缺損,部分可見軟骨下骨暴露(圖1b);HE 染色見軟骨表面不完整,大量潰瘍形成,大部分深達軟骨鈣化層,軟骨4 層結構顯示不清,軟骨細胞顯著減少且形態(tài)、大小不同程度改變,部分標本表層、移行層細胞稀疏,部分潮線消失(圖2b)。對照側關節(jié)軟骨透亮,色澤均勻,表面光整(圖1c);HE 染色軟骨細胞未見明顯改變,細胞呈圓形,散在分布,潮線完整,基質染色正常(圖2c)。

    2.3 并發(fā)癥 造模過程中,3 只實驗兔死亡,A 組1只,B 組2 只,3 只均出現(xiàn)明顯消瘦和持續(xù)腹瀉。所有造模動物均未出現(xiàn)嚴重淤血所致制動管型拆除、開放性骨折和明顯感染、破潰,未出現(xiàn)制動管型脫落、咬除和近端嚴重皮膚磨損等現(xiàn)象。

    3 討論

    OA 動物模型的造模方式主要包括手術法、自發(fā)OA 模型、非手術法[3]。其中手術是目前最常用的造模方式[4],包括關節(jié)腔內手術(交叉韌帶切斷法[5]、半月板切除法[6]、關節(jié)軟骨劃痕法[7]等)、關節(jié)腔外手術(臀肌切斷法[8]、卵巢切除法[9]、下肢靜脈結扎法[10]等)。手術法方法可靠、造模時間短,但對生理結構破壞較大,不利于模擬慢性OA 病理過程和進行藥物治療相關研究。自發(fā)OA 模型是通過篩選具有自發(fā)OA傾向的實驗動物(Hartley 豚鼠、B6C3F1 栗鼠等[11-13])或通過基因敲除誘導小鼠自發(fā)OA[14]。其優(yōu)點是可充分模擬OA 的病理改變、模型病理生理穩(wěn)定,對療效評估等研究也有優(yōu)勢,但造模時間長、成本高。非手術方法包括制動法、關節(jié)撞擊法、關節(jié)腔內注射藥物法等[15-16]。其中關節(jié)制動法既可模擬OA 的病理改變,又能避免手術和藥物注射對關節(jié)腔內環(huán)境的破壞,在藥物篩選和療效評估方面具有一定優(yōu)勢。

    本實驗采用的伸直位制動法主要原理是通過關節(jié)制動限制關節(jié)的主被動活動,使跨越關節(jié)的肌肉和關節(jié)囊收縮、關節(jié)面壓力持續(xù)增高,造成關節(jié)軟骨變性、壞死和關節(jié)軟骨下骨骨質增生[17]。但也具有以下缺陷:①因石膏管型過于寬松或動物啃咬破壞,管型脫落的發(fā)生率較高,需反復固定,導致造模工作繁重、模型穩(wěn)定性欠佳、實驗耗材多。②制動法造模相關并發(fā)癥較多,主要包括遠端肢體血運障礙、動物一般情況差等[18-19],造模成功率較低并增加了實驗成本。③大部分文獻[6,15,18-19]報道,制動法造模造模時間較長,需4~6 周才可達到早期OA 的效果,中期OA效果需7~10 周,明顯長于手術法的造模時間。針對以上問題,很多學者對伸直制動法進行了改良。熊勇等[20]使用伊麗莎白圈防止石膏被啃咬并在左下肢內側安置小鋁板,固定牢靠、成功率高,但自制伊麗莎白圈因實驗動物消瘦而變得過大或過松,影響效果,同時伊麗莎白圈會干擾實驗兔自由活動和進食,增加局部皮損風險。

    本實驗對經(jīng)典伸直制動法進行了以下改良:①采用醫(yī)用高分子固定繃帶。相較于傳統(tǒng)醫(yī)用石膏,醫(yī)用高分子固定繃帶具有良好的抗啃咬性能。4 層及以上高分子固定繃帶可有效減少石膏咬脫,但6 層及以上高分子固定繃帶會增加拆除難度和損傷風險。因此,采用4 層高分子固定繃帶,既能有效制動、防止啃咬脫落,又可方便拆除,可行性較高。②采用“L”型管型。與傳統(tǒng)直型管型不同,“L”型管型可通過踝關節(jié)處的自然彎曲和骨性突起,有效限制管型向下移動和滑脫,極大地降低了脫落概率。③使用壓舌板共同制動。右下肢內側增加壓舌板作為姿勢固定和制動組件,確保膝關節(jié)處于伸直位,避免了不同操作者和不同位置關節(jié)軟骨對實驗效果可能造成的影響。④無需麻醉,通過人工按壓即可完成造模,避免了麻醉對實驗兔的損傷。

    通過以上改良,既保持了伸直位制動的優(yōu)勢,又克服了部分缺陷:①改良伸直制動法模擬OA 的病理改變,縮短了造模所需時間,制動2 周即可觀察到輕度關節(jié)軟骨退變,第6 周退變程度可達中晚期OA的程度,提示僅需控制制動時間,就可模擬不同程度的關節(jié)軟骨退變,滿足各種實驗的需求。②伸直制動法造模效果可靠,成功率高。本實驗所有造模側實驗標本均出現(xiàn)不同程度的軟骨退變,A、B 組內部關節(jié)退變程度基本保持穩(wěn)定,如A 組受累區(qū)域關節(jié)軟骨肉眼下以顏色改變?yōu)橹鳎匆娒黠@缺損、HE 染色觀察軟骨退變主要累及淺層,潮線均完整;B 組受累區(qū)域關節(jié)軟骨可見不同程度缺損,HE 染色可見深大潰瘍形成、均累及鈣化層、軟骨4 層結構顯示不清,潮線大部分或全部消失,退變位置相對固定,未出現(xiàn)因制動管型脫落、咬除或嚴重淤血、破潰而需重新固定的情況。③制動法在保證造模效果的同時,避免了手術和藥物對關節(jié)腔內結構的破壞,同時制動裝置未使用金屬,對影像學研究的開展十分有利。

    本實驗造模過程中3 只動物死亡,原因可能為:運輸過程的高溫環(huán)境和變換飼養(yǎng)環(huán)境使部分實驗兔適應性喂養(yǎng)階段就出現(xiàn)腹瀉及進食、活動較差;造模過程對實驗兔造成了驚嚇、損傷等;制動后,實驗兔主動活動、進食、飲水受到干擾,足趾末端血運障礙等并發(fā)癥對其造成一定影響。

    綜上所述,改良伸直制動法是一種簡單易行、成功率高、實驗過程靈活可控的OA 造模方法,尤其在藥物篩選、療效評估、影像評估等方面具有較大優(yōu)勢。

    圖1 不同制動時間股骨髁關節(jié)軟骨大體病理圖 圖1a 制動2 周時,股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨色澤暗淡不均且發(fā)紅,表面光整 圖1b 制動6 周時,股骨內外側髁后部關節(jié)軟骨表面不光整、不同程度軟骨缺損和軟骨下骨暴露 圖1c 正常對照,關節(jié)軟骨透亮,色澤均勻,表面光整圖2 不同制動時間股骨髁關節(jié)軟骨HE 染色圖(×100)圖2a 制動2 周時,軟骨表面局部不規(guī)則淺裂隙形成,軟骨細胞數(shù)量減少并局部增生、基質染色變淺,潮線完整 圖2b 制動6 周,軟骨大量潰瘍形成,深達軟骨鈣化層,軟骨4 層結構顯示不清,軟骨細胞顯著減少且形態(tài)、大小不同程度改變,潮線消失 圖2c 正常對照,軟骨細胞未見明顯改變,潮線完整,基質染色正常

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