霸王根際解磷細(xì)菌的分離與鑒定

孟建宇 喬宇磊 李蘅

摘 要：以內(nèi)蒙古西鄂爾多斯荒漠灌木霸王為材料，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，使用無機(jī)磷培養(yǎng)基對(duì)霸王根際解磷菌進(jìn)行分離，基于16S rRNA基因序列分析進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果表明：從霸王根際土壤中分離純化得到36株解磷細(xì)菌，分別屬于γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）以及α-變形菌綱（β-Proteobacteria）。第一優(yōu)勢(shì)菌綱為放線菌綱（Actinobacteria），占比為44.45%;分別屬于15個(gè)屬，其中節(jié)桿菌屬（16.7%）、蒼白桿菌屬（13.9%）、芽孢桿菌屬（11.1%）為優(yōu)勢(shì)菌屬。

關(guān)鍵詞：霸王;根際;解磷菌;16S rRNA

中圖分類號(hào) S948 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2020）24-0060-04

Isolation and Identification of Phosphorus-solubilizing Bacteria from Rhizosphere of Zygophyllum xanthonylon

MENG Jianyu et al.

（Applied and Environmental Microbiology Laboratory of Life Sciences College，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010011，China）

Abstract：Traditional isolation and culture technology and inorganic phosphorus media were used to isolate phosphate-solubilizing bacteria from the rhizosphere of Zygophyllum xanthonylon，which is a desert shrub in the Western Ordos of Inner Mongolia. A preliminary identification was based on the 16S rRNA gene. The results showed that a total of 36 phosphate-solubilizing bacteria were isolated，which belonged to γ-Proteobacteria，Bacilli，Actinobacteria，and α-Proteobacteria，respectively. The first dominant class was Actinobacteria with ratio of 44.45%. The isolates belonged to 15 genera，and Arthrobacter（16.7%），Ochrobactrum（13.9%）and Bacillus（11.1%）are the dominant genera.

Key words：Zygophyllum xanthonylon; Rhizosphere; Phosphate-solubilizing bacteria; 16S rRNA

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，是植物體中核酸、蛋白質(zhì)、ATP的重要組分，參與植物體內(nèi)多數(shù)理化反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)[1]。土壤中磷素的固定和轉(zhuǎn)化是通過磷素循環(huán)實(shí)現(xiàn)的，因此，磷素循環(huán)的速率決定了土壤中磷的積存[2]。若磷素循環(huán)較慢，土壤中有效磷含量下降，植物生長(zhǎng)則會(huì)受到抑制。如今，絕大多數(shù)土壤中磷的含量只有2μmol/L，遠(yuǎn)低于植物生長(zhǎng)的需要（2000μmol/L）[3]。為解決土壤含磷量不足的問題，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，將大量磷肥施加于土壤，導(dǎo)致大部分磷元素以難溶的無效態(tài)在土壤中積累，磷肥中含有較多的有害重金屬，過量施加會(huì)引起土壤重金屬污染，引起食物安全問題，對(duì)人類健康造成影響[4，5]。全國農(nóng)田中的有效磷含量利用率不足20%，導(dǎo)致大量的磷積累在土壤中引起諸多的環(huán)境問題，如水體富營養(yǎng)化、赤潮等[6]。

解磷菌（Phosphate-solubilizing bacteria）是土壤中可將難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的一類特殊的微生物功能類群，主要通過分泌各種酶類、有機(jī)酸來活化土壤中的難溶態(tài)磷，提高土壤有效磷含量，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[7-9]。此外，其代謝產(chǎn)物可以影響植物根系的分泌，改變植物根際酸化的現(xiàn)狀[10]。畢銀麗等[11]將植物根際分離得到的解磷菌制成菌肥，施加到荒漠植物的土壤中，土壤有效磷的含量提高，沙土也由酸性土壤變?yōu)橹行酝寥?，酸性磷酸酶的活性增?qiáng)，最終加快植物生長(zhǎng)發(fā)育。解磷菌分布在植物根系周圍的不同位置，表現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng)，即根際土中解磷菌的數(shù)目比根外土壤中多[12]。Hariprasad等[13]對(duì)16株解磷菌進(jìn)行了番茄接種試驗(yàn)，植株經(jīng)處理后，根長(zhǎng)、株高、鮮重、干重和番茄的磷含量均有不同程度的提高;邢芳芳等[14]篩選了1株具有溶磷作用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），盆栽試驗(yàn)表明，經(jīng)解磷菌處理，白菜的葉綠素、生物產(chǎn)量和葉片數(shù)顯著地提高，對(duì)白菜有明顯的促生作用。

霸王[Zygophyllum xanthoxylon（Bunge）Maxim]為蒺藜科，屬于強(qiáng)旱生灌木[15]，在我國西北和內(nèi)蒙古的草原化荒漠地區(qū)分布較為廣泛。其適應(yīng)能力強(qiáng)，抗旱、抗寒、耐貧瘠，并且根系繁盛，生長(zhǎng)快速，產(chǎn)量高，適合在干旱的砂地和多石地區(qū)生長(zhǎng)的特性，對(duì)于保持土壤穩(wěn)定，改善環(huán)境有非常重要的作用[16]。本研究對(duì)霸王根際有解磷能力的細(xì)菌進(jìn)行了初步探索，以期為改良和穩(wěn)定荒漠地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 樣品為2018年7月采集自內(nèi)蒙古西鄂爾多斯荒漠灌木霸王根際土，用已滅菌的刷子輕輕將霸王根際土刷至聚乙烯塑料無菌采樣袋中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 1/2 R2A培養(yǎng)基，無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基（NBRIP）[17]（配制固體培養(yǎng)基加20g瓊脂，pH調(diào)至7.5左右）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解磷細(xì)菌的分離與純化 稱取植物根際土0.5g，加入49.5mL無菌水，震蕩30min，靜置10min。吸取1mL上清液，用無菌水稀釋成10-1～10-6等6個(gè)梯度，各自涂布在固體 NBRIP培養(yǎng)基，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行。26℃條件下培養(yǎng)7d，挑取形態(tài)各異的單菌落劃線純化，獲得單菌落。

1.2.3 菌株的鑒定及其同源性分析 把純化的單菌落挑入1/2R2A液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)渾濁后，吸取菌液加入含30%甘油的1.5mL的無菌保存管中，-80℃保存，同時(shí)進(jìn)行DNA的提取。將提取得到的細(xì)菌DNA模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R[18]進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，利用RDP在線程序Classifier及EzTaxon進(jìn)行同源性分析以確定菌株的種屬關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選的解磷菌 利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，使用無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基，對(duì)內(nèi)蒙古西鄂爾多斯荒漠灌木霸王根際的解磷細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，共篩選得到解磷細(xì)菌36株。菌株的菌落多為白色或無色透明，邊緣光滑，圓形，表面濕潤且黏稠。

2.2 菌株的16S rRNA同源性 分別以36株解磷菌的基因組DNA為模板進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，部分電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。擴(kuò)增片段測(cè)序后，在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示36株菌分屬4個(gè)綱、15個(gè)屬，相似度都在99%～100%（見表1、圖2）。16株屬于放線菌綱（Actinobacteria）類群，其中，GP6、GP7、P2-37-2屬于諾卡氏菌屬（Nocardioides），GP10、P1-10、P1-58-1、P1-58-2、P1-15、P2-4屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter），GP12、HP2屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），GP8、P2-45屬于原小單孢菌屬（Promicromonospora），P2-31屬于紅球菌屬（Rhodococcus），P2-35-1、P2-37-1屬于分支桿菌（Mycobacterium）;8株屬于厚壁菌門的芽孢桿菌綱（Bacilli）類群，其中，GP20、P3-13、P1-2屬于類芽孢菌屬（Paenibacillus），HP4、HP4-1、P3-2、P1-12屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），P2-38屬于威廉姆氏菌屬（Williamsia）;10株屬于變形菌門的α-變形菌綱（α-Proteobacteria）類群，其中，GP16-1、GP16-2、P1-58、P2-6-1、P3-30屬于蒼白桿菌屬（Ochrobactrum），HP1、HP1-1、HP1-4屬于甲基桿菌（Methylobacterium），P2-41屬于根瘤菌屬（Rhizobium），GP9屬于葉桿菌屬（Phyllobacterium）;2株屬于變形菌門的γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）類群，其中，GP22屬于泛菌屬（Pantoea），P1-13-1屬于腸桿菌屬（Enterobacter）。其中節(jié)桿菌屬（6株）占總數(shù)的16.7%，為第一優(yōu)勢(shì)菌屬，蒼白桿菌屬（5株）占總數(shù)的13.9%，為第二優(yōu)勢(shì)菌屬，芽孢桿菌屬（4株）占總數(shù)的11.1%，為第三優(yōu)勢(shì)菌屬。

3 討論與結(jié)論

解磷菌可產(chǎn)生抗真菌的化合物、鐵載體、抗生素、氫氰酸和溶菌酶抵抗病原菌，促進(jìn)植物的生物固氮效率、植物激素的合成和提高Zn、Fe等微量元素的利用，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[19]。解磷菌因其具有較強(qiáng)的植物促生效應(yīng)，對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)和發(fā)育具有顯著的協(xié)同作用[20]，可被作為生物肥料促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[21]。

對(duì)霸王根際解磷菌進(jìn)行研究，篩選出高效解磷細(xì)菌，對(duì)于調(diào)節(jié)土壤磷素的供需矛盾，維護(hù)干旱荒漠地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，改善內(nèi)蒙古地區(qū)的土地荒漠化狀態(tài)具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究從荒漠灌木霸王根際分離純化獲得36株解磷細(xì)菌，分屬15個(gè)屬，與已報(bào)道的文獻(xiàn)中解磷菌種屬類似[21-23]。其中，諾卡氏菌屬（Nocardioides）有3株、原小單孢菌屬（Promicromonospora）有2株、葉桿菌屬（Phyllobacterium）有1株、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）有6株、鏈霉菌屬（Streptomyces）有2株、類芽孢菌屬（Paenibacillus）有3株、泛菌屬（Pantoea）有1株、芽孢桿菌屬（Bacillus）有4株、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）有5株、威廉姆氏菌屬（Williamsia）有1株、分支桿菌（Mycobacterium）有2株、甲基桿菌（Methylobacterium）有3株、腸桿菌屬（Enterobacter）有1株、紅球菌屬（Rhodococcus）有1株、根瘤菌屬（Rhizobium）有1株。在綱水平上，放線菌綱（Actinobacteria）為第一優(yōu)勢(shì)類群（44.45%），α-變形菌綱（α-Proteobacteria）為第二優(yōu)勢(shì)類群（27.78%），再次是芽孢桿菌綱（Bacilli）類群（22.22%），與鞏瑞紅等[23]研究結(jié)果一致，與賈麗娟等[21]研究結(jié)果有差異。在屬水平上，節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）（16.7%）為第一優(yōu)勢(shì)菌屬，蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）（13.9%）為第二優(yōu)勢(shì)菌屬，再次為芽孢桿菌屬（Bacillus）（11.1%），與很多已報(bào)道文獻(xiàn)研究有差異[21-25]。解磷菌的分布與空間條件有關(guān)[26，27]，其多樣性決定于土壤的理化性質(zhì)，如有機(jī)質(zhì)及磷的含量[28]。在受植物影響、有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)更加豐富的植物如作物等根際微生物中，解磷菌的種類和數(shù)量更多樣，群落結(jié)構(gòu)更復(fù)雜[26]。

參考文獻(xiàn)

[1]Lambers H，Shane MW，Carmer MD，et al. Root structure and functioning for efficient acquisition of phosphorus：matching morphological and physiological traits[J]. Annals of Botany，2006，98（4）：693-713.

[2]張藝嚴(yán).我國土壤中磷元素利用現(xiàn)狀及生物措施[J].中國農(nóng)業(yè)信息，2013（15）：99.

[3]Raghothama KG. Phosphate acquisition[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1999，50：665-693.

[4]陳哲，吳敏娜，秦紅靈，等.土壤微生物溶磷分子機(jī)理研究進(jìn)展[J].土壤學(xué)報(bào)，2009，46（5）：925-931.

[5]Gyaneshwar P，Kumar GN，Parekh LJ，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant soil，2002，245（1）：83-93.

[6]Bai Z，Li H，Yang X，et al. The critical soil P levels for crop yield，soil fertility and environmental safety in different soil types[J]. Plant and Soil，2013，372（1）：27-37.

[7]鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學(xué)報(bào)，2005，42（2）：286-294.

[8]Chen YP，Rekha PD，Arun AB，et al. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities[J]. Applied Soil Ecology，2006，34（1）：33-41.

[9]Henri F，Laurette NN，Annette D. et al. Solubilization of inorganic phosphate and plant growth promotion by strains of Pseudomonas fluoreseens isolated from acidic soils of Cameroon[J].African Journal of Microbiology Research，2008，2（7）：171-178.

[10]郎敬.大豆根際解磷菌分離及其定殖分析[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2014.

[11]畢銀麗，于淼，曹楠，等.解磷細(xì)菌對(duì)難溶磷肥的解磷效率比較[J].科技導(dǎo)報(bào)，2011，29（19）：19-23.

[12]王光華，趙英，周德瑞，等.解磷菌的研究現(xiàn)狀與展望[J].生態(tài)環(huán)境，2003，12（1）：96-101.

[13]Hariprasad P，Niranjana SR. Isolation and characterization of hosphate solubilizing rhizobacteria to improve plant health of tomato[J]. Plant and Soil，2009，316（1/2）：13-24.

[14]邢芳芳，高明夫，禚優(yōu)優(yōu)，等.大麥根際高效溶磷菌的篩選、定及促生效果研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，31（S1）：252-257.

[15]劉媖心，楊喜材，姚育英.中國沙漠植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1987：318-320.

[16]周向睿，周志宇，吳彩霞.霸王繁殖特性的研究[J].草業(yè)科學(xué)，2006，23（6）：38-41.

[17]席嬌.荒漠植物的多功能PGPR的分離鑒定及其功能特性研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[18]Karen MK，Sherry LH，Douglas CN. Novel，attached，sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal vents possess vacuoles not involved in respiratory nitrate accumulation[J]. Applied and Environmental Microbiology，2004，70（12）：7487-7496.

[19]Wani P，Khan M，Zaidi A. Co-inoculation of nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacteria to promote growth，yield and nutrient uptake in chickpea[J]. Acta Agronomica Hungarica，2007，55（3）：315-323.

[20]Tallapragada P，Gudimi M. Phosphate solubility and biocontrol activity of Trichoderma harzianum[J].Turkish Journal of Biology，2011，35（5）：593-600.

[21]賈麗娟，唐凱，高曉丹，等.庫布齊沙地生物土壤結(jié)皮中解磷菌的分離鑒定及解磷能力[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2018，24（2）：390-394.

[22]楊鴻儒.西鄂爾多斯荒漠灌木根際細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[23]鞏瑞紅，王小兵，趙吉睿，等.荒漠草原植物根際溶磷細(xì)菌的分離鑒定及其溶磷能力的比較[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2014（4）：6-9.

[24]Mehta P，Walia A，Shirkot CK. Functional diversity of phosphate solubilizing plant growth promoting rhizobacteria isolated from apple trees in the Trans Himalayan region of Himachal Pradesh，India[J].Biological Agriculture & Horticulture，2015，31（4）：265-288.

[25]Hayat W，Aman H，Irshad U，et al. Analysis of ecological attributes of bacterial phosphorus solubilizers，native to pine forests of Lower Himalaya[J]. Applied Soil Ecology，2017，112：51-59.

[26]臧威，孫劍秋，王鵬，等.東北地區(qū)四種農(nóng)作物根際磷細(xì)菌的分布[J].中國農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，17（6）：1206-1210.

[27]李翠，袁紅莉，黃懷曾.官廳水庫沉積物中解磷細(xì)菌垂直分布特征[J].中國科學(xué)D輯，2005，35（S1）：241-248.

[28]Kim KY，Jordan D，McDonald，GA. Effect of PSB and vesicular-arbuscular mycorrhizae on tomato growth and soil microbial activity[J].Biology and Fertility of Soils，1998，26：79-87.

（責(zé)編：張宏民）