建立植物基因組引導編輯技術體系（2020.3.17 中國科學院）

基因組編輯技術可以定向修飾植物基因組，從而大大加速植物育種的進程，是實現(xiàn)作物精準育種的重要技術突破。然而，作物的許多重要農(nóng)藝性狀是由基因組中的單個或少數(shù)核苷酸的改變或突變造成的?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯，可利用外源修復模板通過同源重組介導的修復方式（HDR）實現(xiàn)目標基因特定核苷酸的改變。目前，同源重組在植物中的效率非常低，很難以此方式實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的植物基因組的精準編輯。CRISPR系統(tǒng)所衍生的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，可以分別在基因組靶向位點實現(xiàn)C：G>T：A或A：T>G：C的堿基替換。然而，堿基編輯技術還不能實現(xiàn)其它類型的堿基替換（C：G>A：T和A：T>C：G）及堿基轉換（C：G>G：C和A：T>T：A），更不能實現(xiàn)片段的精準插入和刪除。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要可以高效、精準實現(xiàn)任意堿基替換、增添或刪除的基因組定向編輯技術體系。

哈佛大學教授David R.Liu研究團隊在哺乳動物中開發(fā)了全新的基因組引導編輯（Prime Editing）系統(tǒng)。該系統(tǒng)由nCas9（H840A）融合逆轉錄酶（RT）和pegRNA（prime editing guide RNA））兩部分組成。pegRNA通過在sgRNA骨架的3端引入PBS序列（Primer binding site）結合到nCas9斷裂的非靶標鏈上，逆轉錄酶根據(jù)其攜帶的RT模板逆轉錄出相應的含有目的突變的單鏈DNA。細胞進一步通過DNA損傷修復把目的突變引入基因組。此外，在Cas9非靶標鏈上引入能在產(chǎn)生缺刻的nicking sgRNA，有助于提升引導編輯的效率。近日，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組與David R. Liu研究組合作成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導編輯系統(tǒng)（Plant Prime Editing，PPE），并在重要農(nóng)作物水稻和小麥基因組中實現(xiàn)精確的堿基替換、增添或刪除。

研究人員首先通過PPE系統(tǒng)在水稻和小麥原生質體中實現(xiàn)了16個內(nèi)源位點的精準編輯，包括12種類型的單堿基替換、多堿基替換、小片段的精準插入和刪除，編輯效率最高可達19.2%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)的編輯效率受到PBS和/或RT模板長度以及nicking sgRNA位置的影響。研究人員對PPE系統(tǒng)進行了一系列的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)37℃條件下培養(yǎng)可以顯著提升該系統(tǒng)的編輯效率（1.6倍），通過引入核酶對pegRNA進行自加工，也可以在部分位點提高編輯效率。此外，來源于植物花椰菜花葉病毒和大腸桿菌retron系統(tǒng)的逆轉錄酶可以與nCas9融合在植物中實現(xiàn)精準引導編輯。最后，研究人員通過PPE成功獲得了單堿基突變、多堿基突變及精準刪除的水稻突變體植株，效率最高可達21.8%，這些突變均難以通過現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)實現(xiàn)。雖然Plant Prime Editing系統(tǒng)在部分位點上C：G>T：A或A：T>G：C的效率低于單堿基編輯系統(tǒng)，但是該系統(tǒng)可以實現(xiàn)所有類型的堿基置換，以及堿基增加和刪除。PPE極大地擴展了植物基因組編輯范疇，為植物基因組功能解析及實現(xiàn)作物精準育種提供了重要技術支撐。

研究成果于3月16日在線發(fā)表于Nature Biotechnology雜志（DOI：10.1038/s41587-020-0455-x）。遺傳發(fā)育所高彩霞研究組博士生林秋鵬、博士后宗媛以及博士生薛郴銷為該論文的共同第一作者，高彩霞為論文的通訊作者。高彩霞研究組的研究得到國家自然科學基金、中科院戰(zhàn)略性先導科技專項、國家重點研發(fā)計劃的資助。