黃芪多糖對(duì)肺纖維化大鼠mTOR、p-S6、α-SMA的影響

杜全宇，柳麗娟，朱萬婷，李 莎，張?jiān)铝?/p>

(德陽廣播電視大學(xué)，四川德陽 618000)

彌漫性肺間質(zhì)纖維化根據(jù)病因不同可分為繼發(fā)性和特發(fā)性[1]，特發(fā)性肺纖維化原因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，缺乏有效治療手段，預(yù)后較差[2]。目前的研究認(rèn)為，肺纖維化的主要發(fā)病機(jī)制與肺泡損傷后的異常修復(fù)導(dǎo)致肺內(nèi)成纖維細(xì)胞灶形成密切相關(guān)。肌成纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的活化形式，表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha-Smooth Muscle Action，α-SMA)是其特點(diǎn)，通過阻斷哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是阻斷α-SMA合成的途徑之一[3]。mTOR信號(hào)通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)分化的中心樞紐[4]。最近的研究顯示，mTOR作為一種重要的信號(hào)通路途徑參與了纖維化疾病的發(fā)病，與纖維化病理變化的核心環(huán)節(jié)肌成纖維細(xì)胞的過度增殖有關(guān)[5]。在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中肺纖維化為本虛標(biāo)實(shí)之證，其病機(jī)復(fù)雜，病位在肺[6]，在臨床上使用益氣活血法進(jìn)行治療可較好改善患者癥狀及生存質(zhì)量[7]。本研究選用益氣固表中藥黃芪的主要有效成分黃芪多糖為實(shí)驗(yàn)藥物，以博萊霉素氣管注入致大鼠發(fā)生肺纖維化，以mTOR阻斷劑雷帕霉素為對(duì)照，探尋黃芪多糖和mTOR信號(hào)通路在肺纖維化疾病發(fā)展中的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1儀器

2015型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)Leica儀器有限公司)；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；Zj-003臺(tái)式高速離心機(jī)(安徽科大中佳公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.2 藥物及試劑

多聚甲醛(天津市進(jìn)豐化工有限公司，批號(hào)：20150813)；硫酸博萊霉素、雷帕霉素、黃芪多糖，純度>68%(大連美侖生物，批號(hào)：M0401A、J0102A、A0418A)；無水乙醇、二甲苯、麗春紅(成都科龍化工試劑廠，批號(hào)：20150619、20150918、20150915)；甲苯胺藍(lán)(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：120418)；蘇木素(北京百靈威科技有限公司，批號(hào)：LM10N13)；一抗α-SMA、磷酸化S6核糖體蛋白(phospho-S6 ribosomal protein，p-S6)、mTOR(英國(guó)Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab5694、ab131470、ab32028)；生物素化山羊抗兔IgG(北京中山金橋生物有限公司，批號(hào)：13152A11)；辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素、山羊血清、濃縮型DAB試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液(北京中衫金橋生物有限公司，批號(hào)：13152A11、13152A12、K135925C、ZLI-9062)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠，48只，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(川)2015-24。

2 方法

2.1動(dòng)物分組及給藥

將所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白對(duì)照組(Con)，博萊霉素模型組(BLM)，黃芪多糖(APS)高、中、低劑量組，雷帕霉素對(duì)照組(RAPA)。除空白對(duì)照組外，其余各組均參照文獻(xiàn)[8]采用氣管內(nèi)注射博萊霉素的方法復(fù)制肺纖維化模型，空白對(duì)照組氣管內(nèi)注入等量生理鹽水。于造模第2天開始灌胃給藥，其中Con組和BLM組給予生理鹽水10 mL·kg-1，APS高、中、低劑量組分別給予黃芪多糖800、400、200 mg·kg-1，RAPA組給予雷帕霉素0.5mg·kg-1，連續(xù)給藥28 d。

2.2 一般情況觀察

造模前對(duì)所有大鼠進(jìn)行詳細(xì)觀察，實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測(cè)各組大鼠飲食、飲水、體質(zhì)量、皮毛、呼吸及對(duì)外界刺激的反應(yīng)情況，每周稱體質(zhì)量1次。

2.3 病理學(xué)形態(tài)檢查

各組動(dòng)物麻醉后立即開胸取肺組織，生理鹽水沖洗干凈后使用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、馬松(Masson)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.4 免疫組化檢查

切片常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)抗原后滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加一抗(1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37 ℃作用30 min，PBS清洗3次；滴加辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白試劑，37 ℃作用30 min，PBS清洗4次；DAB顯色；蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠一般情況的影響

實(shí)驗(yàn)期間BLM組大鼠死亡2只，死亡原因可能與造模引起的損傷、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耐受性和藥物的毒性有關(guān)。Con組大鼠攝食飲水良好，反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，毛色光澤，體重逐步增加；BLM模型組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)精神萎靡，動(dòng)作遲緩，喜歡扎堆蜷縮，皮毛光澤減退，呼吸急促，攝食飲水量下降，體重增加緩慢；APS各組和RAPA組大鼠精神較好，反應(yīng)迅速，毛色光澤度較好，呼吸平穩(wěn)，體重逐步增加。

3.2 對(duì)大鼠肺組織病理學(xué)的影響

在肺組織大體形態(tài)上，Con組大鼠雙肺濕潤(rùn)，呈粉紅色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟，無瘀點(diǎn)瘀斑，無充血水腫。BLM模型組大鼠雙肺顏色變暗，彈性下降，表面粗糙不平，部分肺葉可見灰白色、暗紫色結(jié)節(jié)和肺葉萎縮，部分肺葉質(zhì)地較硬，與胸腔內(nèi)其它組織粘連。APS各組大鼠肺組織呈粉紅色，表面較光滑，偶見瘀點(diǎn)，無明顯充血水腫。RAPA組大鼠肺組織顏色稍暗，表面光滑，無瘀點(diǎn)瘀斑，偶見粘連。

HE染色光鏡下見Con組大部分樣本肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無充血水腫。BLM模型組有較多炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，肺泡間隔增厚，肺泡基本結(jié)構(gòu)破壞，以纖維化改變?yōu)橹?。APS各組肺組織結(jié)構(gòu)較清楚，偶見肺間質(zhì)增寬、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、支氣管上皮細(xì)胞水腫和多個(gè)肺泡融合。RAPA組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞較APS組明顯，可見炎性細(xì)胞、肺泡壁斷裂和細(xì)胞水腫。參照Szapiel等的4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定肺泡炎程度，由表1和圖1可見，BLM模型組肺泡炎積分升高，與Con組比較，P<0.01，APS高、中、低劑量組及RAPA組肺泡炎積分較BLM模型組降低，P<0.01。

Masson染色可見空白對(duì)照組大鼠肺組織無明顯纖維化改變。BLM模型組在支氣管壁、血管外壁和增厚的肺泡隔內(nèi)可見較多膠原纖維。APS各組和RAPA組大鼠肺組織中藍(lán)色膠原纖維較BLM組減少。參照Szapiel等的4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定肺纖維化程度，由表2和圖2可見，BLM模型組與空白組比較，大鼠肺組織纖維化積分明顯升高，具有顯著性差異，P<0.01。APS高、中、低劑量組和RAPA組與BLM模型組比較，大鼠肺組織纖維化積分明顯降低，P<0.01。

表1 黃芪多糖對(duì)大鼠肺泡炎積分的影響

注：與空白對(duì)照組比，1)P<0.01；與BLM模型對(duì)照組比，2)P<0.01。

表2 黃芪多糖對(duì)Masson染色后大鼠肺纖維化積分的影響

注：與空白對(duì)照組比，1)P<0.01；與BLM模型對(duì)照組比，2)P<0.01。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果

圖2 各組大鼠肺組織MASSON染色結(jié)果

3.3 對(duì)大鼠肺組織中P-S6、α-SMA、mTOR表達(dá)的影響

由表3和圖3-圖5可見，BLM模型組大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR的平均光密度較空白對(duì)照組明顯升高，P<0.01。APS各組、RAPA組與BLM模型組比較，大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR平均光密度降低，P<0.01。

表3 黃芪多糖對(duì)大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組比，1)P<0.01；與BLM模型對(duì)照組比，2)P<0.01。

圖3 各組大鼠肺組織中p-S6觀察結(jié)果

圖4 各組大鼠肺組織中α-SMA觀察結(jié)果

圖5 各組大鼠肺組織中mTOR觀察結(jié)果

4 討論

肺纖維化后期的病理特點(diǎn)為成纖維細(xì)胞病理性增殖轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性異常積聚并取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)[9]。表達(dá)α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的特征[10]，α-SMA的異常激活在肺纖維化的分子病理機(jī)制中占有極重要的地位[11]。目前的研究顯示[12]，可能阻斷α-SMA合成的途徑主要有三個(gè)方面：使用松弛素B、Rho激酶抑制劑和阻斷mTOR。mTOR是PI3K/Akt信號(hào)通路下游的效應(yīng)蛋白，與纖維化疾病的核心環(huán)節(jié)，肌成纖維細(xì)胞的過度增殖密切相關(guān)[13]。最近的研究顯示，肌成纖維細(xì)胞可出現(xiàn)mTOR信號(hào)調(diào)控異常，參與心臟纖維化[14]、肝臟纖維化[15]、肺纖維化[16]等疾病的發(fā)生。mTOR在細(xì)胞內(nèi)主要參與形成mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物[17]，雷帕霉素是mTORC1通路的阻斷劑，使用雷帕霉素預(yù)先給藥可改善博來霉素所致小鼠肺纖維化的發(fā)生[18]。p-S6是mTOR信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)蛋白，可反映mTOR信號(hào)通路的活化情況。

在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中肺纖維化多歸屬于 “肺痿”“肺痹”“肺脹”等疾病范疇，目前認(rèn)為其主要病機(jī)與肺腎虧虛、氣虛血瘀、痰熱互結(jié)、痹阻肺絡(luò)等相關(guān)[19]。肺腎虧虛是肺纖維化發(fā)病的核心病機(jī)，其中以肺氣虛尤為關(guān)鍵，肺氣虛可引起生痰、致瘀、化熱等病機(jī)變化，而在肺纖維化的臨床治療中以益氣法為基礎(chǔ)，配合活血、通絡(luò)、清熱等在患者的治療中也取得了良好效果。研究顯示，包括黃芪在內(nèi)的多種中藥及其有效成分均對(duì)肺纖維化有抑制作用[20]。黃芪是重要的補(bǔ)氣藥，黃芪多糖是黃芪藥理作用中起決定性因素的一類大分子化合物，既往研究表明，黃芪多糖對(duì)機(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免疫以及非特異性免疫都有較好的調(diào)節(jié)功能[21]。以黃芪為君藥的益氣活血法在對(duì)肺纖維化大鼠的研究中顯示，該法能有效抑制模型大鼠TGF-β1的生成，通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路，干預(yù)肺纖維化進(jìn)程[22]。

本研究結(jié)果顯示，BLM模型組大鼠肺組織內(nèi)α-SMA、p-S6和mTOR的平均光密度明顯升高，提示在博萊霉素所引起的大鼠肺纖維化過程中mTOR信號(hào)通路活化，可能是肺纖維化的重要參與機(jī)制。黃芪多糖可降低博萊霉素所引起的肺纖維化模型大鼠肺組織中p-S6、α-SMA、mTOR等蛋白的平均光密度，降低肺纖維化大鼠的肺泡炎積分和肺纖維化積分，說明黃芪多糖可能通過抑制mTOR及其下游的p-S6的表達(dá)，抑制肌成纖維細(xì)胞特征標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。