響應(yīng)面法優(yōu)化柚皮苷酶對(duì)橘紅的脫苦工藝

劉影 甘釗生 張榕欣

摘 要：采用柚苷酶對(duì)橘紅進(jìn)行脫苦研究。以橘紅脫苦率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化柚皮苷酶對(duì)橘紅的脫苦工藝，確定最佳脫苦條件為：酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間2 h、酶用量為0.8%、pH值為4～5，在此條件下脫苦率可達(dá)25.1%。

關(guān)鍵詞：橘紅;柚皮苷酶;脫苦;響應(yīng)面法

Abstract：Pummelo Peel was debitterized by naringinase treatment. The response surface method was used for optimizing the conditions of debitterizing based on single factor experiment with the index of debitterizing rate. The results showed that the optimum conditions were as follows： enzyme treatment temperature was 60 ℃， enzyme treatment time was 2 h， enzyme dosage 0.8%， soaking solution pH was 4～5. Under this condition， the debitterizing rate reached 25.1%.

Key words：Pummelo peel; Naringinase; Debitterize; Response surface method

中圖分類號(hào)：R284.2

橘紅自古被稱為南方人參，是中國(guó)四大南藥和十大廣藥之一。《本草綱目拾遺》記載，橘紅治痰癥、消油膩、消食、醒酒、寬中、解蟹毒。橘紅目前主要被加工為橘紅片、橘紅成藥、橘紅制劑等藥品。橘紅屬藥食同源物品，既可作為藥材也可作為食品，但橘紅苦味強(qiáng)烈，很難將其加工為口感被大眾喜愛的食品。

黃酮類成分是橘紅的主要有效成分之一[1]，其中柚皮苷占總黃酮含量的80%以上[2]，可達(dá)到橘紅重量的7.87%[3]，柚皮苷苦感強(qiáng)烈，在水里的苦味閾值為20 mg·L-1[4]。柚皮苷的去除方法主要有吸附法、屏蔽法、酶法等，其中酶法脫苦專一性強(qiáng)，是較為理想的脫苦方法[5]。目前已有關(guān)于柚苷酶對(duì)柚子汁、柚子皮、柑橘果汁、金桔汁等的脫苦研究，暫未見橘紅的脫苦研究。本研究首次利用柚皮苷酶對(duì)橘紅進(jìn)行脫苦，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化脫苦工藝，以期將橘紅開發(fā)為口感接受度高的食品，從而推動(dòng)橘紅產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料。橘紅，采摘于廣東省化州市;柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自sigma公司;柚皮苷酶（食品級(jí)），購(gòu)自上海瑞豐實(shí)業(yè)有限公司;檸檬酸、二甘醇、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

儀器。高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（型號(hào)：FW-100，天津市泰斯特儀器有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號(hào)：DK-98-IIA，天津市泰斯特儀器有限公司）;電子天平[型號(hào)：ME-104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-1800PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司）;pH計(jì)（型號(hào)：pHS-3C，上海精密雷磁公司）。

1.2 橘紅脫苦干燥處理

新鮮橘紅于沸水中燙漂2～3 min，切成長(zhǎng)20～30 mm、寬5～10 mm、厚1.0～2.0 mm片狀，加入一定濃度的柚苷酶溶液，在一定溫度和pH條件下脫苦一定時(shí)間，漂洗10 min，瀝干水分，在70 ℃恒溫鼓風(fēng)條件下烘干8 h，粉碎，過100目篩，待用。

1.3 柚皮苷含量測(cè)定

采用Davis[6-7]法對(duì)橘紅中柚皮苷含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取干燥至恒重的柚皮苷標(biāo)樣100.0 mg，添加0.1 mol·L-1的NaOH使其完全溶解，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值到6，定容至250 mL，得到柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋5倍得到溶度0.08 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液，同時(shí)以空白液作標(biāo)準(zhǔn)稀釋用。分別吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液于6支具塞試管中，分別添加空白液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mL和0.0 mL，各加入90%二甘醇5.0 mL和4 mol·L-1

NaOH溶液0.1 mL，置于40 ℃水浴中顯色10 min，立即在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。以柚皮苷含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3.127 9X+0.005 1，R?=0.997。

1.3.2 樣品測(cè)定

①取一定量橘紅粉末，加入0.1 mol·L-1NaOH溶液50 mL，用4 mol·L-1 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12，浸泡30 min，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至6，定容到250 mL。

過濾，收集澄清液，備用。②分別移取樣液0.50 mL于2支具塞試管，加試劑空白液至5 mL，分別加90%二甘醇5 mL，各加4 mol·L-1NaOH溶液0.0 mL和0.1 mL，置于40 ℃水浴中顯色10 min，立即在420 nm

波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，用加堿管的吸光值減去不加堿管的吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程算出所取樣液中柚皮苷含量毫克數(shù)。

1.3.3 橘紅中柚皮苷含量

（1）

式（1）中：A-由待測(cè)液吸光值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的柚皮苷含量，單位mg;V1-樣品測(cè)定時(shí)定容的總體積，單位mL;V2-移取的待測(cè)液體積，單位mL;m-樣品稱取的質(zhì)量，單位g。

1.3.4 脫苦率計(jì)算

脫苦率以水解柚皮苷的程度表示。

1.4 單因素試驗(yàn)

以橘紅脫苦率為考查對(duì)象，選取柚苷酶的用量、酶解的溫度、酶解的時(shí)間和酶解的pH4個(gè)影響柚苷酶脫苦效果的主要因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)研究。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作，選取酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）和酶用量（C）對(duì)脫苦率影響較大的3個(gè)因素為進(jìn)一步研究對(duì)象，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案，試驗(yàn)方案見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度對(duì)脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，在pH值4.0的溶液中加入0.6%的柚苷酶，分別于30、40、50、60 ℃和70 ℃條件下脫苦1.0 h，測(cè)定反應(yīng)溫度對(duì)脫苦率的影響。由圖1可知，柚皮苷酶的脫苦效果受溫度的影響較大，在30～60 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高柚皮苷酶對(duì)橘紅的脫苦效果明顯上升，當(dāng)溫度超過60 ℃

后，脫苦效果隨著溫度的升高反而降低，說明溫度過低，酶活力低會(huì)降低對(duì)橘紅的脫苦效果;溫度過高，酶蛋白會(huì)發(fā)生變性，影響酶活力，也會(huì)降低脫苦效果[8-9]。

試驗(yàn)結(jié)果表明脫苦的適合溫度范圍為50～65 ℃，此時(shí)脫苦效果較好。

圖1 酶解溫度對(duì)橘紅脫苦率的影響圖

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，在pH值4.0的溶液中加入0.6%的柚苷酶，于50 ℃條件下分別脫苦0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h和3.0 h，測(cè)定反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫苦率的影響。由圖2可知，在其他條件一定的情況下，隨著酶作用時(shí)間的增加，脫苦率逐漸增大，在2 h前上升較快，2 h后的上升速率明顯下降，2.5 h后幅度基本保持不變，可能是因?yàn)樵诿附夥磻?yīng)前期，柚皮苷底物含量高，酶解速率高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)柚苷酶發(fā)生變性，酶解反應(yīng)幾乎停止，因此脫苦率基本保持不變[10-11]。為提高生產(chǎn)效率，在保證脫苦率的前提下，酶解時(shí)間應(yīng)越短越好。試驗(yàn)結(jié)果表明脫苦時(shí)間以2 h為佳。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)橘紅脫苦率的影響圖

2.1.3 酶添加量對(duì)脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，在pH值4.0的溶液中分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%的柚苷酶，于50 ℃條件下脫苦1.0 h，測(cè)定酶添加量對(duì)脫苦率的影響。由圖3知，脫苦率隨著酶添加量的增加先升高后降低，在添加0.8%的柚苷酶時(shí)脫苦率達(dá)到最大值，可能是由于當(dāng)酶濃度較低時(shí)，酶解反應(yīng)與酶的濃度成正比。當(dāng)酶濃度過高時(shí)，底物濃度相對(duì)較低，酶與底物接觸機(jī)會(huì)下降，同時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，導(dǎo)致脫苦率降低[9-10]。綜合考慮，酶用量為0.6%～1.0%范圍內(nèi)脫苦效率較好。

圖3 酶添加量對(duì)橘紅脫苦率的影響圖

2.1.4 酶解pH對(duì)脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，分別在pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的溶液中添加0.6%的柚苷酶，于50 ℃條件下脫苦1.0 h，測(cè)定溶液pH值對(duì)脫苦率的影響。由圖4知，用柚皮苷酶對(duì)橘紅進(jìn)行脫苦，當(dāng)溶液的pH值在4以下時(shí)，隨著pH值的增加脫苦率明顯增大;當(dāng)溶液的pH值在5以上時(shí)，隨著pH值的增加脫苦率降低;溶液pH值在4～5時(shí)脫苦率較高且比較穩(wěn)定。說明酶對(duì)底物進(jìn)行作用時(shí)，有其適宜的pH值范圍，若不在酶作用的最適pH值范圍，酶本身的活性將受到影響，發(fā)揮不了對(duì)底物應(yīng)有的作用[11]。因此用柚皮苷酶對(duì)橘紅進(jìn)行脫苦時(shí)，pH值在4～5的范圍內(nèi)，效果較好。

圖4 酶解pH對(duì)橘紅脫苦率的影響圖

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

以橘紅脫苦率為考查指標(biāo)，通過Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共有17個(gè)試驗(yàn)方案，其中12個(gè)試驗(yàn)為析因試驗(yàn)，5個(gè)試驗(yàn)為中心試驗(yàn)用來估算誤差。試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

2.2.2 回歸方程的建立及方差分析

運(yùn)用Design Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次多項(xiàng)式回歸模型。以橘紅脫苦率（Y）為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程為：

Y=24.38+0.62A+0.38B+0.23C-0.57BC-0.60A2-0.65B2-0.31C2

通過方差分析和相關(guān)系數(shù)可考察模型的可靠性，結(jié)果見表3。

模型的P值<0.000 1，表明二次方程擬合顯著。失擬項(xiàng)P值0.528 5>0.05，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.939 6，說明模型的響應(yīng)值，即橘紅脫苦率變化的93.96%來源于所選變量，即柚苷酶用量、酶解時(shí)間和酶解溫度。因此，此模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度和可信度較高，可利用此回歸方程確定橘紅的最佳脫苦工藝條件。

回歸方程方差分析中各變量的P值表明：一次項(xiàng)A，一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)BC，二次項(xiàng)A2和B2對(duì)橘紅脫苦率（Y值）的影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)C和二次項(xiàng)C2對(duì)橘紅脫苦率（Y值）的影響顯著（P<0.05）。說明各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)橘紅脫苦率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。3個(gè)影響因素中，對(duì)橘紅脫苦率影響最大的為酶解溫度，其次為酶解時(shí)間，影響最小的為酶添加量。

2.2.3 響應(yīng)面分析

各試驗(yàn)因素的交互作用對(duì)橘紅脫苦率（Y值）的影響如圖5、圖6、圖7所示。由圖5可知，橘紅脫苦率隨著各因素水平的增大先增大后減小。由等值線圖可知，擬合面脫苦率存在最高值，說明各因素都有一個(gè)對(duì)應(yīng)的最適值存在。

其中，圖7的響應(yīng)面較陡峭，說明酶解時(shí)間和酶添加量二者間的交互作用是極顯著的。而圖5和圖6的響應(yīng)面較緩，說明酶解溫度和酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)脫苦率的影響相對(duì)較小，符合方差分析的結(jié)果。

2.2.4 橘紅脫苦工藝的確定與驗(yàn)證

通過回歸方程預(yù)測(cè)出橘紅脫苦的最佳工藝條件為柚苷酶用量0.832%，酶解時(shí)間2.11 h，酶解溫度61.325 ℃。在此條件下，脫苦率在理論上可達(dá)到24.6 %。

為方便實(shí)際操作，對(duì)預(yù)測(cè)得到的理論條件進(jìn)行微調(diào)，即：酶解溫度為60 ℃，酶解時(shí)間為2 h，酶用量為0.8%。在此條件下重復(fù)3次脫苦試驗(yàn)以驗(yàn)證模型的有效性。3次試驗(yàn)的平均脫苦率為25.1%，與預(yù)測(cè)值24.6%相比，其相對(duì)誤差為2.0%。說明采用響應(yīng)面試驗(yàn)得到的柚皮苷酶對(duì)橘紅脫苦的工藝參數(shù)是可靠的，具有一定的實(shí)際價(jià)值。

3 結(jié)論

采用柚皮苷酶對(duì)橘紅進(jìn)行脫苦，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度為自變量，以橘紅脫苦率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法優(yōu)化橘紅酶法脫苦最佳工藝條件為酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間為2 h、酶用量為0.8%，在此條件下脫苦率可達(dá)25.1%。

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