水稻轉(zhuǎn)基因成分快速檢測(cè)方法基層應(yīng)用分析

丁寧

摘要 ? ?水稻轉(zhuǎn)基因越來(lái)越多地被廣大群眾所關(guān)注，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部保持遏制非法轉(zhuǎn)基因的高壓態(tài)勢(shì)，轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)成為縣區(qū)級(jí)一項(xiàng)常規(guī)性檢測(cè)任務(wù)，如何在速測(cè)過(guò)程中確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免假陽(yáng)性或者假陰性成為基層工作者亟待解決的問(wèn)題。本文重點(diǎn)介紹了基層主要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分分類(lèi)、安全性、現(xiàn)場(chǎng)穩(wěn)定性、靈敏度、檢測(cè)原理、檢測(cè)步驟及應(yīng)用，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性、有效性和可比較性。

關(guān)鍵詞 ? ?水稻;轉(zhuǎn)基因;快速檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) ? ?S188 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

水稻是江蘇第一大糧食作物，水稻質(zhì)量安全問(wèn)題對(duì)保障老百姓生活至關(guān)重要。對(duì)于水稻的轉(zhuǎn)基因工作，2009—2018年每年農(nóng)業(yè)部辦公廳都發(fā)布關(guān)于開(kāi)展農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管檢查工作的通知，要求開(kāi)展轉(zhuǎn)基因監(jiān)測(cè)工作;各省市每年都下發(fā)進(jìn)行農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管工作的通知，開(kāi)展轉(zhuǎn)基因成分快速檢測(cè)工作。從法律層面來(lái)講，《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》（2017年11月30日修訂版）第三十二條明確縣級(jí)以上地方各級(jí)人民政府農(nóng)業(yè)行政主管部門(mén)負(fù)責(zé)本行政區(qū)域內(nèi)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全的監(jiān)督管理工作[1];《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管項(xiàng)目資金管理辦法》第二章第四條規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管項(xiàng)目資金主要用于單獨(dú)列出農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全管理，轉(zhuǎn)基因安全例行監(jiān)測(cè)及生產(chǎn)環(huán)境安全長(zhǎng)期監(jiān)測(cè);行政執(zhí)法、跨區(qū)監(jiān)管及重點(diǎn)地區(qū)轉(zhuǎn)基因安全專(zhuān)項(xiàng)檢查[2]。宿遷市是蘇北糧食生產(chǎn)大市，全市水稻種植面積21.47萬(wàn)hm2，品種多、亂、雜的局面沒(méi)有完全改變。為了確保農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全，防止轉(zhuǎn)基因水稻非法生產(chǎn)，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障市民健康，開(kāi)展水稻轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，確保水稻生物安全性尤其重要，提升基層轉(zhuǎn)基因工作監(jiān)管能力成為亟待解決的問(wèn)題。

1 ? ?水稻轉(zhuǎn)基因成分分類(lèi)

1.1 ? ?抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因

目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用比較多的是抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因和抗除草劑轉(zhuǎn)基因，抗蟲(chóng)基因主要有Bt殺蟲(chóng)基因的cry1Ab、cry1Ac、cry1C和cry2A等十幾種[3]，Cry1Ab和Cry1Ac是目前在作物轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)育種上應(yīng)用最多的一類(lèi)Bt殺蟲(chóng)蛋白，可以特異性地毒殺二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲(chóng)，殺蟲(chóng)效果十分理想。

1.2 ? ?抗除草劑轉(zhuǎn)基因

抗除草劑基因具有耐除草劑草甘膦特性的CP4 EPSPS、耐除草劑甲胺磷的特性的bar基因、抗除草劑溴苯腈基因（bxn基因）等，草甘膦是世界上使用范圍最廣的除草劑，其除草的作用機(jī)理是通過(guò)抑制莽草酸途中的EPSPS合酶，阻礙芳香族氨基酸的合成，擾亂植物正常的氮代謝而使其死亡[4-5]。

1.3 ? ?抗病轉(zhuǎn)基因

張長(zhǎng)偉[6]將苦瓜幾丁質(zhì)酶基因McCHIT1、苜蓿防御素基因alfAFP及其雙價(jià)基因成功地導(dǎo)入水稻恢復(fù)系縉恢35中，得到了一批對(duì)稻瘟病、紋枯病抗性明顯增強(qiáng)的植株后代。

1.4 ? ?抗逆性轉(zhuǎn)基因

抗逆性轉(zhuǎn)基因有耐冷、耐干旱、耐鹽堿、耐淹等各類(lèi)為了提高水稻品質(zhì)而引入的抗逆性基因。

1.5 ? ?市面上主要轉(zhuǎn)基因品種

目前，市面上存在的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)水稻有TT51-1（bt63）、Ⅱ優(yōu)科豐6號(hào)、克螟稻和耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62和LLRICE601等，是各基層監(jiān)管單位進(jìn)行監(jiān)管的主要對(duì)象。

2 ? ?轉(zhuǎn)基因安全性

據(jù)陳友倩等水稻轉(zhuǎn)基因及其安全性研究進(jìn)展介紹，轉(zhuǎn)基因存在抗藥性、過(guò)敏性、產(chǎn)生有毒物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不良影響、生物多樣性等安全性問(wèn)題。

3 ? ?轉(zhuǎn)基因速測(cè)卡現(xiàn)場(chǎng)穩(wěn)定性和靈敏度

何 ?景等在轉(zhuǎn)基因速測(cè)卡的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用性能及其可行性研究中得出，Cry1Ab/1Ac速測(cè)卡靈敏度最低可達(dá)0.25%，無(wú)交叉反應(yīng)性，與Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)5種模擬實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果一致，能夠滿足達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)的目的，適用于轉(zhuǎn)基因成分的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為100 μg/kg。

4 ? ?轉(zhuǎn)基因成分速測(cè)原理

轉(zhuǎn)基因速測(cè)的主要原理為利用雙抗體夾心法，首先將轉(zhuǎn)基因蛋白特異的抗體，偶聯(lián)于顯色試劑，并摻入試紙條，當(dāng)試紙條被插入含有轉(zhuǎn)基因蛋白的植物組織的少量萃取物時(shí)，偶聯(lián)抗體與蛋白之間就發(fā)生了結(jié)合，與偶聯(lián)于顯色試劑上的某些但不是全部抗體形成夾心物。膜片含有2個(gè)捕獲區(qū)，一個(gè)捕獲區(qū)可捕獲結(jié)合的轉(zhuǎn)基因蛋白，另一個(gè)捕獲區(qū)可捕獲顯色試劑。當(dāng)夾心物和未反應(yīng)的顯色試劑被膜片上的特定區(qū)捕獲時(shí)，這些捕獲區(qū)就顯現(xiàn)出紅色。若膜片上僅存在1條紅色對(duì)照線，說(shuō)明受檢樣品為陰性樣品;若存在2條線，說(shuō)明受檢樣品為陽(yáng)性樣品[4-5]。

5 ? ?轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)步驟

5.1 ? ?取樣

對(duì)區(qū)域內(nèi)品種展示區(qū)、制種區(qū)、雜交稻種植區(qū)等進(jìn)行集中采集，采集時(shí)做好GPS定位，并做好抽樣單的填寫(xiě)。取樣具體要求為取水稻葉片直徑1 cm左右的圓形葉片組織2片，放到2 mL刻度尖底離心管中，或者取磨碎后的過(guò)100目的水稻種子0.25 g，用記號(hào)筆標(biāo)注樣品編號(hào)。

5.2 ? ?提取

每個(gè)水稻葉片樣品中加0.20 mL主要成分為磷酸的提取緩沖液，用力上下振蕩使樣品和緩沖液充分接觸混合，用玻璃棒搗碎，顏色變綠時(shí)可以準(zhǔn)備檢測(cè);如果取樣為水稻種子，則加主要成分為磷酸的提取緩沖液0.75 mL進(jìn)行溶解，蓋好蓋子，進(jìn)行上下振蕩提取20～30 s，為了確保樣品與緩沖液充分混勻，靜置一段時(shí)間等待固體物質(zhì)沉淀在管底，待上面澄清后就可以作為測(cè)試液進(jìn)行測(cè)定，提取樣品時(shí)要小心操作，避免交叉污染。

5.3 ? ?測(cè)定

速測(cè)試紙恢復(fù)至常溫，放于水平桌面上，用槍吸75 μL蛋白樣品上清液于底端或者將速測(cè)試紙按照箭頭方向直接插入樣品上清液中，試紙浸沒(méi)入0.5 cm，不要超過(guò)箭頭上端黑色標(biāo)記線，從上樣開(kāi)始倒計(jì)時(shí)，結(jié)果在5～8 min內(nèi)讀取，否則判讀無(wú)效，取出的速測(cè)紙要盡快使用，避免環(huán)境對(duì)速測(cè)紙產(chǎn)生不利影響。

5.4 ? ?結(jié)果判斷

陰性樣品T線不顯色;陽(yáng)性樣品T線顯色肉眼可見(jiàn);無(wú)效樣品顯示為未出現(xiàn)T線上部的C線。

5.5 ? ?注意事項(xiàng)

一是在4～10 ℃條件下進(jìn)行避光干燥保存，不能冷凍，試紙的有效期為12個(gè)月，拆封1 h內(nèi)盡快使用，溫度高于30 ℃或高濕度條件下要做到即開(kāi)即用。二是樣品中固體雜質(zhì)顆粒會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，取樣時(shí)靜置取上清液進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)進(jìn)行離心取上清液做檢測(cè)。三是采用水稻植株樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)，只需要變綠即可，不用太碎，液體太綠容易在條上吸附葉綠素，導(dǎo)致假陽(yáng)性問(wèn)題。

6 ? ?轉(zhuǎn)基因速測(cè)應(yīng)用

每年僅宿豫區(qū)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)就至少有53個(gè)水稻品種，轉(zhuǎn)基因速測(cè)具有用時(shí)短（只需要10～15 min）、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，具有良好的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用性能，能夠滿足基層對(duì)生物安全性監(jiān)測(cè)的要求。轉(zhuǎn)基因速測(cè)技術(shù)是基層農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的重要手段，切實(shí)提高了監(jiān)管能力，同時(shí)持續(xù)強(qiáng)化研發(fā)、制種環(huán)節(jié)監(jiān)管，查早查小，嚴(yán)厲打擊違法違規(guī)行為，確保水稻生物安全性[6]。

7 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 農(nóng)業(yè)部科技教育局.農(nóng)業(yè)部關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作的通知[EB/OL].（2010-06-06）[2019-10-12].http：//jiuban.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201006/t20100606_1533955.htm.

[2] 農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管項(xiàng)目資金管理辦法》的通知[EB/OL].（2017-12-05）[2019-10-12].http：//jiuban.moa.gov.cn/sjzz/cws/fagui/201712/t20171205_5962970.htm.

[3] 吳振映，柳絮.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)cry2A抗蟲(chóng)基因水稻的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011（5）：1-3.

[4] 農(nóng)業(yè)大省黑龍江明年5月起全面禁止轉(zhuǎn)基因作物[EB/OL].（2016-12-17）[2019-10-12].http：//news.sohu.com/20161217/n476141506.shtml.

[5] 阮先樂(lè)，張杰.轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法綜述[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（5）：12-15.

[6] 張長(zhǎng)偉.轉(zhuǎn)McCHIT1、alfAFP基因及其雙價(jià)基因水稻的稻瘟病和紋枯病抗性研究[D].重慶：西南大學(xué)，2011.