檸檬醛猴樟莖段組織培養(yǎng)技術(shù)研究

肖祖飛 王玲玲 曹璐瑤 廖文軒 金志農(nóng)* 李 鳳

呂雄偉1 張北紅1 趙 姣1

(1.南昌工程學(xué)院江西省樟樹(shù)繁育與開(kāi)發(fā)利用工程研究中心，南昌 330099； 2.江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330096)

檸檬醛猴樟(Cinnamomumbodinierivar.citralifera)是指枝葉精油主成分主含檸檬醛的猴樟，屬樟科樟屬植物，特產(chǎn)我國(guó)，分布于云南、四川、湖北、湖南、貴州等省，尤以貴州分布最廣[1]。檸檬醛猴樟樹(shù)形優(yōu)美、冠大陰濃，材質(zhì)堅(jiān)實(shí)、有光澤、有香味，枝葉可提取精油，是重要的園林綠化、用材、油用樹(shù)種。目前，對(duì)其的研究有形態(tài)解剖學(xué)[2]、生態(tài)學(xué)特性[3]、栽培與繁育[4]、造林技術(shù)[5]、抗逆性[6]、精油的提取與化學(xué)成分分析[7]等方面，除抗寒性研究較多外，其他方面研究均較少，關(guān)于猴樟組織培養(yǎng)研究未見(jiàn)報(bào)道。本文以檸檬醛猴樟一年生半木質(zhì)化枝條為材料，研究采集季節(jié)、消毒時(shí)間和激素對(duì)檸檬醛猴樟莖段組織培養(yǎng)的影響，同時(shí)探索檸檬醛猴樟生根組培苗的煉苗、移栽技術(shù)，旨在為檸檬醛猴樟的無(wú)性繁殖提供理論依據(jù)，為更好開(kāi)發(fā)與利用檸檬醛猴樟提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)自南昌工程學(xué)院樟樹(shù)種質(zhì)資源圃的5年生檸檬醛猴樟。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料采集時(shí)間對(duì)檸檬醛猴樟莖段培養(yǎng)的影響

分別于2017年5月中旬、7月中旬和9月中旬采集生長(zhǎng)健壯的一年生半木質(zhì)化枝條，剪取帶1～2個(gè)芽的莖段(1.5～3.0 cm)，沖洗2 h，置于超凈工作臺(tái)，75%酒精的浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞(HgCl2)消毒5 min，接種在MS+1.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA培養(yǎng)基，每瓶1個(gè)莖段，30瓶，3次生物重復(fù)。接種30 d，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和腋芽萌芽率。

1.2.2 消毒時(shí)間對(duì)檸檬醛猴樟莖段培養(yǎng)的影響

于2017年5月中旬,選取生長(zhǎng)健壯半木質(zhì)化枝條，剪取帶1～2個(gè)芽的莖段(1.5～3.0 cm)，沖洗2 h，置于超凈工作臺(tái)，75%酒精的浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為3、5、7和9 min，用無(wú)菌水沖洗3～5次，莖段放在無(wú)菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS+1.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA培養(yǎng)基，每瓶1個(gè)莖段，30瓶，3次生物重復(fù)。接種30 d，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和腋芽萌芽率。

1.2.3 激素濃度對(duì)檸檬醛猴樟莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

于2017年5月中旬,選取生長(zhǎng)健壯半木質(zhì)化枝條，剪取帶1～2個(gè)芽的莖段(1.5～3.0 cm)，沖洗2 h，置于超凈工作臺(tái)，75%酒精的浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞進(jìn)行消毒5 min，用無(wú)菌水沖洗3～5次，莖段放在無(wú)菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS培養(yǎng)基，添加6-BA(0.25、0.50、1.00、2.00 mg·L-1)，IBA(0.05、0.10、0.20、0.40 mg·L-1)。每個(gè)處理30瓶，每瓶1個(gè)莖段。接種30 d，統(tǒng)計(jì)腋芽萌芽率。

1.2.4 激素濃度對(duì)檸檬醛猴樟增殖培養(yǎng)的影響

挑選生長(zhǎng)健壯、葉片舒展光亮、株高3～5 cm的無(wú)菌苗，修剪成莖段，莖段至少帶有一葉一芽(1.5 cm)，接種在MS培養(yǎng)基，添加6-BA(0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1)，IBA(0.05、0.10、0.15、0.20 mg·L-1)。每個(gè)處理20瓶，每瓶7～8個(gè)莖段。繼代培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)增殖芽數(shù)、苗高、莖粗。

1.2.5 檸檬醛猴樟生根誘導(dǎo)培養(yǎng)研究

挑選生長(zhǎng)健壯、葉片舒展光亮、株高3～5 cm的無(wú)菌苗接種于1/2MS培養(yǎng)基，添加IBA(0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1)，每瓶7～10株。生根培養(yǎng)25 d統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)、根粗和根長(zhǎng)。

1.2.6 檸檬醛猴樟生根苗煉苗和移栽技術(shù)研究

生根培養(yǎng)20～22 d，將組培生根苗移至透光25%～30%，溫度25～30℃的大棚內(nèi)煉苗7～10 d。用自來(lái)水清洗干凈生根苗根部培養(yǎng)基，置于帶有少量清水的托盤(pán)。移栽前將生根苗用0.5%多菌靈粉劑進(jìn)行消毒30 min，之后移入裝滿基質(zhì)的無(wú)紡布袋中央，用噴壺澆透水。之后保持基質(zhì)濕潤(rùn)，見(jiàn)干即澆，每次澆透。移栽2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

株高、根長(zhǎng)用米尺測(cè)量、地徑、根粗用游標(biāo)卡尺測(cè)定。采用Excel2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入、整理和方差分析。

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100

(1)

褐化率(%)=(褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100

(2)

萌芽率(%)=(萌芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100

(3)

增殖系數(shù)=新增殖芽數(shù)/原接入芽數(shù)

(4)

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接入株數(shù))×100

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 材料采集時(shí)間對(duì)檸檬醛猴樟莖段培養(yǎng)的影響

由表1可知，不同時(shí)間采集材料對(duì)檸檬醛猴樟莖段初代培養(yǎng)有顯著影響，隨采集時(shí)間的延后，污染率和褐化率顯著提高，萌芽率顯著降低。5月中旬，外植體污染率最低，為17.78%，顯著低于7月中旬(28.89%)和9月中旬(41.11%)，褐化率也是最低，為11.11%，與7月中旬差異不顯著，顯著低于9月中旬(21.11%)，5月中旬萌芽率最高，高達(dá)56.67%，顯著高于7月中旬和9月中旬，9月中旬萌芽率最低，為25.56%。

表1 材料采集時(shí)間對(duì)檸檬醛猴樟莖段培養(yǎng)的影響

Table 1 Effects of material collection time on stem segment culture ofC.bodinierivar.citralifera

采集時(shí)間Collection time污染率Pollution rate(%)褐化率Browning rate(%)萌芽率Germination rate(%)5月中旬Mid-May17.78±2.43c11.11±1.89b56.67±4.12a7月中旬Mid-July28.89±1.67b13.33±1.51b40.00±2.65b9月中旬Mid-September41.11±3.18a21.11±1.20a25.56±1.67c

注：表中同一列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes:Different normal letters in the same column indicate significant differences among treatments atP<0.05.The same as below.

2.2 消毒時(shí)間對(duì)檸檬醛猴樟莖段培養(yǎng)的影響

由表2可知，隨著消毒時(shí)間的增加，檸檬醛猴樟莖段組織培養(yǎng)污染率逐漸降低，褐化率逐漸升高，萌芽率先升高后下降。檸檬醛猴樟莖段消毒3 min，污染率高達(dá)65.56%，顯著高于其他處理，消毒5和7 min污染率在15%～20%，二者差異不顯著，顯著高于消毒9 min，消毒9 min污染率最低，為8.89%。檸檬醛猴樟莖段消毒9 min褐化率最高，為56.67%，顯著高于其他處理，其次是消毒7 min，褐化率為24.44%，消毒5和3 min，褐化率較低，分別為12.22%和5.56%。消毒5 min，萌芽率最高，為57.78%，顯著高于其他消毒時(shí)間，其次是消毒7 min，萌芽率最低的是消毒3 min。因此，5月份采集檸檬醛猴樟半木質(zhì)化枝條，修剪成1～2芽莖段，0.1%升汞消毒5 min，進(jìn)行初代培養(yǎng)，萌芽率最高，污染率和褐化率較低。

2.3 激素濃度對(duì)檸檬醛猴樟莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

由表3可知，檸檬醛猴樟萌芽率隨6-BA濃度的增加而升高，隨IBA濃度的增加而降低，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1、IBA濃度為0.05 mg·L-1時(shí)，檸檬醛猴樟萌芽率達(dá)到最高60.00%，其次是2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA，萌芽率最低的是1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1IBA，萌芽率為16.67%。因此，誘導(dǎo)檸檬醛猴樟莖段萌芽最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA。

表2 消毒時(shí)間對(duì)檸檬醛猴樟莖段培養(yǎng)的影響

Tabel 2 Effect of disinfection time on stem segment culture ofC.bodinierivar.citralifera

消毒時(shí)間Disinfection time(min)污染率Pollution rate(%)褐化率Browning rate(%)萌芽率Germination rate(%)365.56±3.42a5.56±0.37d10.00±1.67c518.89±1.85b12.22±1.03c57.78±2.59a716.67±1.40b24.44±3.16b35.56±2.26b98.89±1.17c56.67±3.95a16.67±1.73c

表3 激素配比對(duì)檸檬醛猴樟莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

Tabel 3 Effects of hormone ratio on stem segment germination induction culture ofC.bodinierivar.citralifera

處理Treatment接種莖段Number of stem segment culture萌芽莖段Number of stem segment germination萌芽率Germination ratioMS+0.25mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA30723.33MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301136.67MS+1.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301860.00MS+2.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301653.33MS+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA301240.00MS+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IBA30826.67MS+1.0mg·L-16-BA+0.4mg·L-1IBA30516.67

2.4 激素濃度對(duì)檸檬醛猴樟增殖培養(yǎng)的影響

由表4可知，在IBA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的增加，檸檬醛猴樟莖段的增殖系數(shù)先升高后稍降低的趨勢(shì)。處理2，檸檬醛猴樟莖段增殖系數(shù)最高，為4.33，顯著高于處理1，與處理3和處理4差異不顯著。在6-BA濃度不變，檸檬醛猴樟莖段的增殖系數(shù)隨著IBA濃度的增加呈現(xiàn)先基本不變，當(dāng)濃度達(dá)到0.2 mg·L-1，增殖系數(shù)顯著增加，顯著高于其他處理。株高較大的是處理7(3.98 cm)、處理6(3.81 cm)和處理3(3.72 cm)，其次是處理1、處理2和處理5，最差的是處理4(3.40 cm)。各處理地徑生長(zhǎng)差異不顯著。因此，檸檬醛猴樟最適增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA。

2.5 IBA對(duì)檸檬醛猴樟組培苗生根的影響

2.5.1 檸檬醛猴樟組培苗生根過(guò)程基部形態(tài)變化

檸檬醛猴樟組培苗生根培養(yǎng)1～5 d，基部形態(tài)基本沒(méi)有變化；培養(yǎng)7 d時(shí)，少部分組培苗基部膨大，有少量愈傷；培養(yǎng)11 d時(shí)，部分組培苗不定根突破表皮，不定根出現(xiàn)；培養(yǎng)14 d時(shí)，組培苗不定根進(jìn)行生長(zhǎng)，不定根明顯(圖1)，之后不定根增長(zhǎng)、增粗生長(zhǎng)。

表4 激素配比對(duì)檸檬醛猴樟增殖培養(yǎng)的影響

Tabel 4 Effects of hormone ratio on proliferation culture ofC.bodinierivar.citralifera

處理Treatment激素配比Hormone ratio(mg·L-1)6-BAIBA增殖系數(shù)Multiplication株高Plant height(cm)地徑Ground diameter(cm)處理1Treatment 10.50.201.83±0.47c3.46±0.32cd1.14±0.11a處理2Treatment 21.00.204.33±0.73a3.67±0.17bcd1.04±0.05a處理3Treatment 31.50.204.08±0.61a3.72±0.06abc1.08±0.09a處理4Treatment 42.00.204.00±0.45a3.40±0.14d1.28±0.27a處理5Treatment 51.00.052.33±0.16b3.62±0.21bcd0.90±0.05a處理6Treatment 61.00.102.33±0.25b3.81±0.09ab1.15±0.18a處理7Treatment 71.00.152.00±0.08bc3.98±0.13a1.06±0.04a

圖1 1.5 mg·L-1 IBA誘導(dǎo)檸檬醛猴樟組培苗生根過(guò)程Fig.1 Induction of rooting process of tissue culture seedlings of C.bodinieri var. citralifera by 1.5 mg·L-1 IBA

2.5.2 IBA對(duì)檸檬醛猴樟組培苗生根的影響

由表5可知，IBA對(duì)檸檬醛猴樟組培苗生根有顯著促進(jìn)作用。隨著IBA濃度的增加，生根率先升高后降低，1.5 mg·L-1IBA處理，生根率達(dá)到75%，顯著高于其他處理，其次是2.0mg·L-1IBA處理(68.75%)，生根率最低的是0.5 mg·L-1IBA處理。1.5 mg·L-1IBA處理，根數(shù)最多，達(dá)到3.5，其次是2.0 mg·L-1IBA處理(3.06)，0.5 mg·L-1IBA處理，根數(shù)較少，為2.40。根長(zhǎng)和根粗各處理差異不顯著。因此，檸檬醛猴樟最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg·L-1IBA。

2.6 檸檬醛猴樟生根苗的移栽和苗期管理

生根培養(yǎng)20～22 d，將組培生根苗移至透光25%～30%，溫度25～30℃的大棚內(nèi)煉苗7～10 d。之后用醫(yī)用鑷子將生根苗取出，用自來(lái)水清洗干凈生根苗根部培養(yǎng)基，置于帶有少量清水的托盤(pán)。移栽前將生根苗放入40%多菌靈粉劑0.5%溶液中消毒5～10 min，用醫(yī)用鑷子小心將生根苗移入裝滿基質(zhì)的無(wú)紡布袋中央，稍微壓實(shí)基質(zhì)，以防苗木基部松動(dòng)，隨即用噴壺澆透水。之后保持基質(zhì)濕潤(rùn)，見(jiàn)干即澆，每次要澆透。根數(shù)大于3，移栽成活率可達(dá)80%以上，苗木木質(zhì)化后可將苗移入大田定植(圖2)。

表5 IBA對(duì)檸檬醛猴樟生根的影響

Tabel 5 Effect of IBA on rooting ofC.bodinierivar.citralifera

處理Treatment生根率Rooting rate(%)根數(shù)Number of root根長(zhǎng)Root length(cm)根粗Root diameter(cm)1/2MS+0.5mg·L-1IBA31.15±3.83d2.40±0.21c4.79±09.47a0.74±0.08a1/2MS+1.0mg·L-1IBA40.00±3.15c2.63±0.16bc5.32±0.95a0.69±0.12a1/2MS+1.5mg·L-1IBA75.00±2.27a3.50±0.18a5.06±0.82a0.82±0.10a1/2MS+2.0mg·L-1IBA68.75±5.06b3.06±0.33ab5.28±0.64a0.71±0.07a

圖2 檸檬醛猴樟組培苗定植Fig.2 Planting of tissue culture seedlings of C.bodinieri var. citralifera

3 討論

組織培養(yǎng)具有操作簡(jiǎn)單、繁殖系數(shù)高、脫毒、可周年生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，可以在短期內(nèi)獲得大規(guī)模苗木，滿足市場(chǎng)需求，是木本植物快速、高效無(wú)性繁殖的主要方式。目前，關(guān)于猴樟的組織培養(yǎng)研究未見(jiàn)報(bào)道，而同屬植物樟樹(shù)的組織培養(yǎng)研究較多。

基本培養(yǎng)基是影響組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，木本植物組織培養(yǎng)常用基本培養(yǎng)基有MS、DCR、B5、WPM等培養(yǎng)基，其中樟樹(shù)組織培養(yǎng)采用較多的基本培養(yǎng)基是MS[8～9]，也有研究表明B5培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更適合樟樹(shù)愈傷組織的生長(zhǎng)[10]，DCR基本培養(yǎng)基較適合樟樹(shù)芽的培養(yǎng)[11]。本試驗(yàn)中檸檬醛猴樟莖段的誘導(dǎo)萌芽和增殖采用MS基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)采用1/2MS培養(yǎng)基，獲得較好的效果，關(guān)于其他基本培養(yǎng)基是否適合檸檬醛猴樟的組織培養(yǎng)有待進(jìn)一步研究。

取材時(shí)間不同，外植體發(fā)育狀況不同，生理狀態(tài)不同，影響植物組織培養(yǎng)成功。外植體消毒時(shí)間太短，外植體消毒不干凈，污染率高；消毒時(shí)間太長(zhǎng)，污染率低，但對(duì)外植體殺傷力大，褐化嚴(yán)重。有研究表明一年中1～4月份采集香樟外植體接種，感菌率低，無(wú)菌活體獲得率超過(guò)50%[12]。也有研究表明，香樟4～6月取材，感菌率最高，8月前后，感菌率最低[13]。本研究結(jié)果表明，5月中旬采集檸檬醛猴樟半木質(zhì)化枝條，修剪成一葉一芽莖段，0.1%升汞消毒5 min，莖段腋芽萌芽率最高，褐化率和污染率較低。這可能與枝條木質(zhì)化程度和枝條在環(huán)境中暴露時(shí)間有關(guān)，5月中旬，半木質(zhì)化枝條生長(zhǎng)旺盛，腋芽處于活動(dòng)狀態(tài)，細(xì)胞容易誘導(dǎo)，而且枝條與外界環(huán)境接觸不久，表面灰塵、細(xì)菌較少。

外源激素是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因子，在外植體的誘導(dǎo)、不定芽的分化與增殖及芽苗生根培養(yǎng)過(guò)程中，外源激素發(fā)揮重要的作用。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)激素的研究一直停留在憑經(jīng)驗(yàn)摸索的基礎(chǔ)上，對(duì)于同一植物，所用激素種類和濃度說(shuō)法不一。BA、NAA和IBA是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣的激素。有研究表明6-BA對(duì)香樟芽的增殖影響較大，與低濃度的IBA配合使用有利于芽的增殖，采用MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA培養(yǎng)基進(jìn)行芽的增殖，增殖系數(shù)最高，達(dá)到6.1。芽苗接入1/2MS+0.2 mg·L-1IBA培養(yǎng)5 d，之后轉(zhuǎn)入1/2MS無(wú)激素培養(yǎng)基培養(yǎng)，生根率最高，達(dá)到93.6%，并且生根數(shù)大于3、最長(zhǎng)根大于2 cm的苗超過(guò)80%[14]。MS培養(yǎng)基中加入Ca(NO3)2適合香樟初代培養(yǎng)，究其原因可能是：一方面可以提供苗木更多的Ca2+，同時(shí)NO3有利于K+、Mg2+、Ca2+等陽(yáng)離子的吸收，另一方面可以避免初代的褐化。6-BA和IAA配合使用，香樟叢生芽分化正常，生長(zhǎng)健壯，叢生芽誘導(dǎo)適宜培養(yǎng)基為MS2(MS+Ca(NO3)2)+4～5 mg·L-16-BA+2 mg·L-1IAA，繼代增殖培養(yǎng)基為MS2+3～3.5 mg·L-16-BA+2 mg·L-1IAA，生根培養(yǎng)基為MS2+3.0 mg·L-1IBA+1.5 mg·L-1IAA+50～100 mg·L-1氯化膽堿，生根率為85%[15]。也有研究表明GA3對(duì)芳樟不定芽的增殖有一定影響，芳樟在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3培養(yǎng)基上，月增殖系數(shù)能夠達(dá)到15[16]。本研究結(jié)果表明，檸檬醛猴樟莖段萌芽最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA，萌芽率為60%。檸檬醛猴樟增殖適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA，增殖系數(shù)為4.33，適宜生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg·L-1IBA，生根率為75%。