羽衣甘藍類蛋白質二硫鍵異構酶PDIL1-2的基因克隆及蛋白表達分析

李 陽 施亞坤 高士科 李曉嶼 藍興國

(東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

蛋白質二硫鍵異構酶(PDIs)及其類蛋白(PDILs)是硫氧還蛋白超家族的成員,不僅具有催化蛋白質二硫鍵氧化、還原和異構的功能，而且還具有分子伴侶活性和參與新陳代謝的功能[1～5]。典型的PDI由5個結構域(a,b,b’,a’,c)以及一個N端信號肽和C端的內質網滯留信號(KDEL)組成。其中a型結構域(a和a’區(qū))與硫氧還蛋白(Trx)家族具有同源性，分別包含一個氧化還原活性位點-CGHC-,能催化蛋白質二硫鍵的氧化與還原[6]；b型結構域(b和b’區(qū))二級結構與a型相似，具有異構酶的活性和與底物結合的能力；c區(qū)的C末端富含酸性氨基酸，是Ca2+結合區(qū)域并具有異構酶的活性[7～8]。

PDILs主要是由a型和b型同源結構域以不同的排列方式組合而成。PDILs目前主要分為6簇，1簇除典型結構域(a,b,b’,a’,c)外還含有N末端酸性結構域；2簇為真菌PDI，含a，a’或a，b，a’結構域；植物的PDI大多在3簇，含有典型的5個結構域(a,b,b’,a’,c)；4簇僅有a結構域；5簇中的PDI含有與典型結構域不同的D結構域；大部分動物的PDI屬于6簇，含有a,b,b’,a’結構域[3]。它們多數(shù)具有催化蛋白質二硫鍵氧化還原的功能和分子伴侶活性，其間差異可能體現(xiàn)在底物的結合能力和組織特異性、表達水平和調控模式上[9～10]。

目前，在動物和真菌中的研究發(fā)現(xiàn)，PDI和PDILs不僅與癌癥、精卵細胞的融合有關[11～12]，而且在細胞穩(wěn)定、離子吸收、基因活化和細胞分化等方面具有重要的作用[13]。在植物研究中，從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)等克隆了一些PDIs和PDILs[14～19]。擬南芥中的PDILs有12種，其中AtPDIL1的表達能夠提高脅迫條件下種子的萌發(fā)和幼苗根的生長[20]。水稻中的PDILs有12種，其中OsPDIL1-1參與胚乳內質網上谷蛋白和醇溶蛋白的成熟過程[21～22]，它的缺失導致水稻粉狀淀粉的形成和對內質網脅迫的響應[18]。小麥中的PDILs蛋白有9種，它們與面筋蛋白的合成有關[23]。玉米中的PDILs蛋白有12種，它們受干旱、冷、ABA和鹽等逆境脅迫誘導表達[13]。甘薯中分離出了PDIL的cDNA，其中SPPDI1具有脫氫抗壞血酸還原酶活性和單脫氫抗壞血酸還原酶活性[24]。胡蘿卜中分離出了PDI，可催化胰島素中二硫鍵的氧化還原和變性RNase A的復性[25]。

目前植物PDILs的生物學功能研究主要集中在種子萌發(fā)調控及逆境響應等方面，然而在其他方面的功能仍亟待研究[26～27]。在本研究中將羽衣甘藍自交不親和系(S13-bS13-b)作為研究材料，利用RT-PCR和RACE方法分離羽衣甘藍PDIL1-2基因并進行序列分析，通過原核表達純化系統(tǒng)獲得BoPDIL1-2的融合蛋白，并制備多克隆抗體和免疫印跡分析BoPDIL1-2組織表達模式以及在柱頭發(fā)育過程中的表達情況，從而為深入研究BoPDIL1-2的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

于2017年6月在東北林業(yè)大學花卉生物工程研究所種植羽衣甘藍自交不親和系(S13-bS13-b)。在2018年2月～4月開花期間，采集當天開花的花蕾和莖、葉，用鑷子分別剝取花柱、花瓣、柱頭、子房和花藥，選取不同花蕾長度(S1-S5)的柱頭為不同發(fā)育時期材料，用液氮速凍后，存于-80℃冰箱備用[28]。

1.2 羽衣甘藍PDIL1-2全長cDNA的分離

利用CTAB法從羽衣甘藍柱頭中提取總RNA[29]。使用DnaseⅠ酶(RNase free)消化后的柱頭總RNA作為模板，采用錨定引物Oligo(dT)18和AMV反轉錄酶(TaKaRa)進行RNA反轉錄，程序為：42℃孵育30 min，99℃變性5 min，4℃孵育5 min。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已經發(fā)表甘藍PDIL1-2基因的5′和3′末端序列，設計一對特異性引物PDIL1-2-RT-For和PDIL1-2-RT-Rev(表1),模板為反轉錄產物cDNA的第1條鏈，使用LA taq DNA聚合酶(TaKaRa)進行PCR擴增。擴增條件為：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，進行35次循環(huán)后，72℃延伸7 min。用E.Z.N.A.TMGel Extract kit對PCR產物進行回收，回收后與pGEM-T載體連接，轉化到Top10菌株中，用藍白斑篩選法挑選陽性克隆并檢測核酸序列。

根據(jù)所得的PDIL1-2的cDNA(BoPDIL1-2)序列，分別設計5′RACE的特異性引物PDIL1-2-SP1和PDIL1-2-SP2，及3′RACE的特異性引物PDIL1-2-SP5(表1),按照RACE試劑盒Roche 5′/3′ RACE Kit，2ndGeneration說明書進行cDNA末端快速擴增。利用試劑盒引物Oligo(dT)-Anchor primer和PCR Anchor primer，采用嵌套PCR和Touchdown PCR進行擴增。將得到的5′末端序列和3′末端序列以及中間序列拼接，得到cDNA的全長序列，利用NCBI網站進行BLAST比對，并用在線網站ProtParam(http://www.expasy.org)預測編碼蛋白的分子量、保守結構域及理論等電點等。

1.3 羽衣甘藍PDIL1-2的原核表達、純化及多克隆抗體制備

1.3.1 原核表達質粒pET-14b-BoPDIL1-2的構建

引物PDIL1-2-pET-For(5′-GACGGTACCATGGCGTCTAACGGCTTCGC-3′)，下劃線代表KpnⅠ酶切位點；PDIL1-2-pET-Rev(5′-GACGGATCCCTACAGCTCGTCCTTCGCGG-3′)，下劃線代表BamHⅠ酶切位點。以PDIL1-2的cDNA(BoPDIL1-2)編碼序列為模板，利用KOD高保真酶進行PCR擴增。擴增條件為94℃變性15 s，55℃退火30 s，68℃延伸2 min，30個循環(huán)后，72℃延伸7 min。對PCR產物進行回收、純化和雙酶切后，插入pET-14b載體中。將重組載體轉化到大腸桿菌DH5α中，經PCR和酶切鑒定正確后，進行核酸序列分析。

表1 羽衣甘藍BoPDIL1-2基因克隆及原核表達分析所用引物

1.3.2 BoPDIL1-2重組蛋白質的原核表達

經鑒定后正確的陽性重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中。在5 mL LB培養(yǎng)基中加入單菌落，于37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期A600=0.6，加入終濃度為1 mmol·L-1的異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導4 h后進行12%的SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后對其表達進行檢測。

1.3.3 BoPDIL1-2融合蛋白的純化及多克隆抗體制備

大量擴增誘導并收集細菌；用5 mL結合緩沖液重懸細菌沉淀(30 mmol·L-1NaCl；10 mmol·L-1咪唑；20 mmol·L-1Tris-base；pH 8.0)，細菌經超聲破碎后，12 000 r·min-1、4℃離心15 min。Poly-Prep chromatography column層析柱被結合緩沖液平衡后，加上清，并向其中加入100 μL Ni2+-NTA瓊脂糖(Novagen公司)，4℃結合30 min后，依次用20、30和40 mmol·L-1咪唑洗脫緩沖液對Ni2+-NTA瓊脂糖進行洗脫，最后用250 mmol·L-1咪唑洗脫并收集融合蛋白。過濾含有目的蛋白的洗脫液Amicon? Ultra-4(3 kD截流，Millipore公司)，然后用PBS緩沖液(2.68 mmol·L-1KCl，1.46 mmol·L-1KH2PO4，137 mmol·L-1NaCl，8.1 mmol·L-1Na2HPO4，pH7.4)進行透析。利用獲得的重組BoPDIL1-2融合蛋白免疫小鼠，制備BoPDIL1-2多克隆抗體，具體方法參考Li等[30]。

1.4 BoPDIL1-2在不同組織及柱頭不同發(fā)育時期的表達

采集羽衣甘藍莖、葉、花柱、花瓣、子房、柱頭、花藥，以及花蕾大小在S1(0～4.0 mm)、S2(4.1～6.0mm)、S3(6.1～8.0 mm)、S4(8.1～10.0 mm)和S5(>10.1 mm)時的柱頭，總蛋白提取及蛋白定量參照Lan等的方法[26]。

1.5 免疫印跡

取已經定量的蛋白樣品各10 μg，進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后將蛋白轉移至PVDF膜(Amersham Biosciences)中。在室溫下，用含有5%牛血清白蛋白(BIOSHARP)的TBST(137 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1Tris base，0.1% Tween-20)封閉1 h。一抗為Anti-BoPDIL1-2，稀釋倍數(shù)為1∶2 000。二抗為山羊抗鼠抗體，其上偶聯(lián)有辣根過氧化物酶，稀釋倍數(shù)為1∶5 000。經一抗、二抗結合后，把LumiGLO混合液(Cell Signaling Technology)均勻地滴在PVDF膜上，用Kodak IS2000R進行化學發(fā)光檢測。

2 結果與分析

2.1 羽衣甘藍PDIL1-2基因的克隆、序列分析及蛋白結構域分析

用羽衣甘藍柱頭總RNA作為模板，以RT-PCR法獲得長度為1 545 bp的cDNA序列。然后分別通過5′RACE和3′RACE的方法獲得長度為415 bp的5′末端序列和341 bp的3′末端序列。將cDNA序列和5′末端序列以及3′末端序列進行拼接，獲得了一個1 689 bp的全長cDNA序列，將其命名為BoPDIL1-2，GenBank登錄號為MK241691。BoPDIL1-2的全長cDNA含有一個1 530 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，對應編碼一個含509個氨基酸殘基的蛋白質，52 bp的5′非翻譯區(qū)和107 bp的3′非翻譯區(qū)(圖1)。BoPDIL1-2的理論等電點(pI)為5.00，相對分子質量約為55.7 kD。氨基酸序列比對分析結果表明，BoPDIL1-2與油菜BnPDIL1-2具有97.3%的一致性，與擬南芥AtPDIL1-2具有85.5%的一致性(圖2)。

蛋白結構域分析結果顯示，BoPDIL1-2蛋白由一個N端的信號肽(SP)、中間4個結構域(a,b,b’,a’)和C末端攜帶內質網滯留信號肽KDEL組成(圖3)。a和a’區(qū)與硫氧還蛋白(Trx)家族有同源性，都包括一個氧化還原活性位點-CGHC-；b和b’區(qū)和硫氧還蛋白沒有同源性，但其二級結構同a或a’相似。

2.2 羽衣甘藍PDIL1-2原核表達分析

利用PCR方法擴增PDIL1-2的編碼序列，通過雙酶切消化構建到pET-14b載體上，通過測序確定構建了pET-14b-BoPDIL1-2表達質粒。將構建好的pET-14b-BoPDIL1-2表達質粒，轉化到BL21(DE3)pLysS菌株中。在37℃下用IPTG誘導4 h，裂解細菌。SDS-PAGE電泳結果表明，在經IPTG誘導后的菌液蛋白中，有一條58 kDa左右的蛋白條帶被特異性地誘導出來(圖4)。由于考慮到表達載體表達His6標簽等氨基酸的分子量，因此認為這個誘導58 kDa的蛋白與預測重組蛋白質的分子量相符。大量擴增表達菌液后，利用超生方法破碎細胞，通過Ni2+-NTA親合樹脂純化后，進行SDS-PAGE電泳。從圖4中的結果顯示出，重組蛋白質(His6-BoPDIL1-2)純化出來，而且蛋白的純度較高。利用純化的重組蛋白免疫小鼠，制備BoPDIL1-2的多克隆抗體。

圖1 羽衣甘藍BoPDIL1-2全長cDNA核苷酸序列及其推測的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA nucleotide sequence of BoPDIL1-2 and its putative amino acidsequence

圖2 羽衣甘藍BoPDIL1-2與油菜BnPDIL1-2、擬南芥AtPDIL1-2氨基酸序列比對 彩色背景為不一致的氨基酸序列。Fig.2 Alignment of predicted amino acid sequences among BoPDIL1-2,Brassica napus BnPDIL1-2 and Arabidopsis thaliana AtPDIL1-2 Colorful background are different residues.

圖3 羽衣甘藍BoPDIL1-2蛋白的結構域 SP.信號肽；KDEL.賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸四肽序列,為內質網滯留信號；a、b、a’、b’為羽衣甘藍PDIL1-2的四個結構域(a和a’區(qū)與硫氧還蛋白(Trx)家族同源；b和b’區(qū)和硫氧還蛋白不同源)Fig.3 The protein domain of BoPDIL1-2 SP.Signal peptide; KDEL.Lysine-aspartic acid-glutamic acid-leucine,a signal for endoplasmic reticulum retention; a,b,a’,b’ are the four domains of Ornamental Kale of PDIL1-2(a and a’ regions are homologous to the thioredoxin(Trx) family; b and b’ regions are different from Trx )

圖4 BoPDIL1-2蛋白的誘導表達純化 1.誘導前細菌蛋白；2.誘導后細菌蛋白；M.蛋白分子量標準；3.純化的目的蛋白Fig.4 Induction and purification of recombination BoPDIL1-2 1.Bacteria protein before IPTG induction；2.Bacteria protein after IPTG induction；M.Protein marker; 3.Purification of target protein

圖5 免疫印跡分析BoPDIL1-2在植物各組織中的表達水平Fig.5 Western blot analysis of BoPDIL1-2 expression levels in various tissue

圖6 免疫印跡分析BoPDIL1-2在柱頭發(fā)育過程中的表達水平Fig.6 Western blot analysis of BoPDIL1-2 expression levels in the different developmental stigma

2.3 免疫印跡分析BoPDIL1-2在各組織和柱頭發(fā)育中的表達水平

為了分析BoPDIL1-2在植物組織中的表達水平，分別提取莖、葉、花瓣、柱頭、花柱、子房和花藥的總蛋白。利用制備的BoPDIL1-2多克隆抗體，通過免疫印記的方法檢測BoPDIL1-2的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)在檢測的各組織中，在56 kD處有特異性條帶出現(xiàn)，這與預測的BoPDIL1-2大小相近；BoPDIL1-2在柱頭中的表達量最高，在莖、葉、花瓣、花柱、子房和花藥表達量較低(圖5)。這個結果說明在檢測的組織樣品中，BoPDIL1-2特異性地在柱頭中表達。

為了進一步分析BoPDIL1-2在不同發(fā)育階段柱頭的表達情況，提取了S1到S5階段的柱頭總蛋白。免疫印記的結果顯示，在柱頭發(fā)育的早期階段S1階段，BoPDIL1-2的表達幾乎檢測不到；到S2階段，BoPDIL1-2表達量逐漸升高；從S3到S5階段柱頭表達量較高(圖6)。這個結果表明BoPDIL1-2表達與柱頭發(fā)育密切相關，可能在柱頭發(fā)育過程中具有重要的作用。

3 討論

本研究從羽衣甘藍自交不親和系(S13-bS13-b)中分離出BoPDIL1-2基因。它的全長cDNA序列為1 689 bp，包含52 bp的5′非翻譯區(qū)、107 bp的3′非翻譯區(qū)和1 530 bp的開放閱讀框，對應編碼一個含509個氨基酸殘基的蛋白質。對其結構域進行分析，發(fā)現(xiàn)BoPDIL1-2蛋白由一個N端的信號肽(SP)、中間4個結構域(a,b,b’,a’)和C末端的內質網滯留信號肽KDEL組成；它屬于Meiri等規(guī)定的第三簇。a和a’區(qū)與硫氧還蛋白(Trx)家族同源有同源性，都包括一個氧化還原活性位點；b和b’區(qū)和硫氧還蛋白家族沒有同源性,但其二級結構同a或a’相似。這說明BoPDIL1-2的活性與蛋白質二硫鍵異構酶相似，都具有催化蛋白質二硫鍵氧化、還原和異構的功能，此外，還可能有其他的生物學功能。氨基酸序列比對分析顯示，BoPDIL1-2與油菜BnPDIL1-2具有97.3%的一致性，與擬南芥AtPDIL1-2具有85.5%的一致性，這暗示這個蛋白在進化過程中是保守的。此外，利用原核表達系統(tǒng)進行BoPDIL1-2融合蛋白的表達純化。在原核表達分析中，58kD處發(fā)現(xiàn)了被誘導出來的蛋白，其分子量與預測的融合蛋白相符；在純化的過程中并未形成包涵體，因此利用Ni2+-NTA樹脂通過親和層析的方法獲得高純度的BoPDIL1-2融合蛋白。

在免疫印跡中，BoPDIL1-2蛋白在柱頭組織中表達量最高，在莖、葉、花瓣、花柱、子房和花藥表達量較低；這與擬南芥中PDIs在花和未成熟種子中表達量較高具有一定的相似性[6,30]；這也暗示了BoPDIL1-2可能特異性地參與柱頭的生物學功能。在羽衣甘藍柱頭的不同發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)，BoPDIL1-2在S1階段幾乎不表達；從S2階段開始BoPDIL1-2的表達量逐漸升高；在S3到S5階段BoPDIL1-2的表達量較高。這個結果表明BoPDIL1-2的表達與柱頭發(fā)育密切相關，暗示了BoPDIL1-2可能在柱頭發(fā)育過程中具有重要的作用。

本試驗通過對羽衣甘藍BoPDI1-2基因進行克隆，對其進行序列及結構域的分析，豐富了對蕓苔屬植物PDIL1-2基因的認識。并通過對該基因在組織、柱頭發(fā)育的表達量分析，認為BoPDIL1-2可能在柱頭發(fā)育過程中起到重要的作用，這對羽衣甘藍的培育和推廣具有重要價值和意義，也為探討植物中PDI的生物學功能提供了重要線索；但其具體作用機制仍不明確，在后續(xù)研究中我們將繼續(xù)對BoPDIL1-2基因在羽衣甘藍柱頭發(fā)育過程的具體功能和作用機制進行分析。