盆炎凈膠囊的HPLC指紋圖譜及聚類、主成分分析

周和 譚翔勻 馮華 王奧

【摘?要】?目的：建立盆炎凈膠囊的高效液相色譜指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析和主成分分析。方法：色譜柱為waters XSelect HSS T3 （4.6mm × 250mm， 5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.5%醋酸溶液，梯度洗脫，檢測波長235nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。以芍藥苷為參照，測定10批盆炎凈膠囊指紋圖譜;采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（版本 2004 A）”和SPSS 19.0軟件進(jìn)行綜合分析。結(jié)果：10批樣品相似度均在0.95以上，確認(rèn)共有峰18個(gè)，并指認(rèn)了3個(gè)已知化合物（馬錢苷、芍藥苷、原兒茶酸）;聚類分析可將樣品聚為2類;篩選出4個(gè)主成分因子，累積方差貢獻(xiàn)率94.696%。結(jié)論：該方法簡單有效，可為盆炎凈膠囊的質(zhì)量控制提供一定的參考。

【關(guān)鍵詞】??盆炎凈膠囊;質(zhì)量控制;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析

【中圖分類號(hào)】R284.1???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號(hào)】1007-8517（2020）5-0027-05

HPLC Fingerprint，Cluster and Principal Component Analysis of ?Penyanjing capsule

ZHOU He1?TAN Xiangyun1?FENG Hua1?WANG Ao2*

1.Zunyi Institute for Food & Drug Control，Zunyi 563002，China; 2. Zunyi Product Quality Inspection and Testing Institute，Zunyi 563002，China

Abstract：

Objective To establish an HPLC fingerprints of Penyanjing capsule，and conduct cluster analysis（CA）and principal component analysis（PCA）. Methods Waters XSelect HSS T3 （4.6mm × 250mm，5μm） as analytical column and acetonitrile-0.5% acetic acid solution as mobile phase in a gradient mode. Detecting wavelength was set at 235nm. The temperature of column was at 25℃，the sample size was 10μL. Total 10 batches of Penyanjing capsule samples were determined by selected paeoniflorin as a reference. Comprehensive analysis was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM（2004 A edition） and SPSS 19.0 software. Results The similarities in 10 batches of Penyanjing capsule samples were greater than 0.95. There were 18 common peaks in the HPLC fingerprints and identified 3 compounds（loganin，paeoniflorin，protocatechuic acid）. The samples were classified into two types according to CA. Four principal component factors were selected，and the cumulative contribution rate was 94.696%. Conclusion This simple and effective method can provide some reference for the quality control of Penyanjing capsule.

Key?words：Penyanjing capsule;Quality control;Fingerprint;Cluster analysis;Principal component analysis

盆炎凈膠囊處方由忍冬藤、川芎、狗脊、雞血藤、赤芍、車前草等八味中藥材組成[1]，具有和血通絡(luò)、清熱利濕、調(diào)經(jīng)止帶的功效，主要用于白帶過多、濕熱下注等癥狀[2]。盆炎凈膠囊作為中藥復(fù)方制劑，具有多藥味、多成分、多靶點(diǎn)協(xié)調(diào)作用的特點(diǎn)，常規(guī)檢測只能檢測其單個(gè)或幾個(gè)成分，不能全面、有效、準(zhǔn)確地說明中藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量和確切療效[3-4]。因而，建立更科學(xué)有效、更系統(tǒng)完整的檢測方法，對(duì)控制盆炎凈膠囊質(zhì)量具有重要意義。中藥指紋圖譜具有整體性、相似性的特點(diǎn)，是一種能突出中藥及其制劑完整面貌的有效方法。結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、系統(tǒng)聚類分析與主成分分析，有助于中藥及其制劑中多種化學(xué)成分的綜合評(píng)價(jià)，從而控制其整體質(zhì)量。近年來，該技術(shù)已廣泛用于中藥及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)[5-12]。因此，本研究采用HPLC法中的梯度洗脫模式，建立了10批盆炎凈膠囊高效液相指紋圖譜。通過系統(tǒng)聚類分析與主成分分析，挖掘指紋圖譜中蘊(yùn)含的其他信息，對(duì)盆炎凈膠囊進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為盆炎凈膠囊的質(zhì)量控制提供一定的參考。

1?儀器與試藥

1.1?儀器與試劑?Agilent高效液相系統(tǒng)（配有四元梯度泵，光電二極管陣列檢測器，柱溫箱，Agilent 1260工作站和處理軟件），Waters XSelect HSS T3 （4.6mm × 250mm，5μm）柱;XPE56型十萬分之一電子天平（梅特勒），KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2?試劑與藥品?馬錢苷、芍藥苷、原兒茶酸對(duì)照品（購于中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別：111640-201808、110736-20184、211809-201205），乙睛、磷酸為色譜純，水為娃娃哈純凈水，其余試劑為分析純，10批次盆炎凈膠囊（批號(hào)分別為：190601、190602、190603、190604、190605、190701、190702、190703、190704、190705）遵義華衛(wèi)制藥提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?色譜柱waters XSelect HSS T3 （4.6mm ×250mm，5μm）;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%醋酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）;檢測波長為235nm;流速：1.0mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量：10μL。

2.2?溶液制備

2.2.1?對(duì)照品溶液?稱取原兒茶酸、馬錢苷、芍藥苷對(duì)照品適量，分別用甲醇溶解制成含原兒茶酸0.10mg/mL、馬錢苷0.31mg/mL、芍藥苷0.52mg/mL的單一對(duì)照品溶液，搖勻，用0.45μm 的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2?供試品溶液?取盆炎凈膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約2.0g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱重，超聲50min，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.3?方法學(xué)考察

2.3.1?精密度試驗(yàn)?取上述供試品溶液（批號(hào)：190701），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣檢測6次，記錄色譜圖。以芍藥苷峰（10號(hào)峰）為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.63%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于0.95%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.2?重復(fù)性試驗(yàn)?取盆炎凈膠囊（批號(hào)：190701）內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，共6份，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，18個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.93%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.56%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.2.3?穩(wěn)定性試驗(yàn)??。ㄅ?hào)：190701）同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24h進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。以芍藥苷峰（10號(hào)峰）為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1.87%，表明在室溫條件下，供試品溶液24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4?指紋圖譜

2.4.1?指紋圖譜的生成?取10批盆炎凈膠囊內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法，依次制備10批供試品溶液，再按“2.1”色譜條件測定，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖。如圖1、圖2所示。

2.4.2?相似度分析?采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（版本 2004 A）”，以樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，詳見表2。結(jié)果顯示，10批樣品相似度均大于0.95以上，表明各樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

2.4.3?指認(rèn)共有峰?分別取“2.2.1”項(xiàng)下原兒茶酸（狗脊藥材所含成分）、馬錢苷（忍冬藤藥材所含成分）、芍藥苷（赤芍藥材所含成分）單一的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，并與樣品的HPLC對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行對(duì)比指認(rèn)。結(jié)果，共有峰中3、7、10號(hào)色譜峰分別指認(rèn)為原兒茶酸、馬錢苷、芍藥苷。如圖3所示。

2.4.4?共有峰的相關(guān)分析?10批樣品共有18個(gè)共有峰，其峰面積總和占色譜峰總面積的92.96%。由圖3可知，10號(hào)峰芍藥苷峰面積較大，位置適中，與相鄰色譜峰分離度>2.26，在色譜中穩(wěn)定，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其它共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果見表3、表4。

2.5?聚類分析?采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，變量為10批盆炎凈膠囊HPLC指紋圖譜中標(biāo)定的21個(gè)共有峰的絕對(duì)峰面積，先標(biāo)準(zhǔn)化原始數(shù)據(jù)，再依據(jù)歐氏距離依次進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果詳見圖4。由圖4可知，10批盆炎凈膠囊可分為2類，樣品S1、S2、S8可聚為一類，S3、S4、S5、S6、S7、S9、S10可聚為一類。

2.6?主成分分析

2.6.1?主成分因子特征值、方差貢獻(xiàn)率分析?以特征值>1為主成分因子的篩選標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行主成分因子分析，并計(jì)算其特征值和方差貢獻(xiàn)率。由表5可知，共有4個(gè)主成分因子的特征值符合要求，分別為：8.857、3.792、2.252、2.144。4個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為94.696%，說明前4個(gè)主成分可代表樣品大部分信息，適用于主成分分析。依據(jù)主因子載荷絕對(duì)值越大，對(duì)主成分貢獻(xiàn)越大，由表6可知，主成分因子1反映了峰1、2、4、5、7、8、9、10、14、15、16的信息，主成分因子2反映了峰3、6、13、17、18的信息，峰11、18在主成分因子3上有較高的載荷，峰12在主成分因子4上有較高的載荷。

2.6.2?綜合質(zhì)量評(píng)分?計(jì)算4個(gè)主成分因子的得分和綜合得分（綜合得分=主成分因子得分×），對(duì)10批盆炎凈膠囊樣品質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)并排序，結(jié)果見表7。由表7可知，主成分因子綜合得分最高的為S5號(hào)樣品（批號(hào)：190605），成分7、9、10、14在該批樣品中含量相對(duì)較高，整體質(zhì)量相對(duì)較好。

3?討論

本研究成功建立了10批盆炎凈膠囊的指紋圖譜，確認(rèn)18個(gè)共有峰，并指認(rèn)出了3個(gè)已知成分，分別為原兒茶酸（3號(hào)）、馬錢苷（7號(hào)）、芍藥苷（14號(hào)）。由圖譜可以看出芍藥苷峰面積較大，響應(yīng)高，位置適中，故選擇芍藥苷為參照峰。經(jīng)多次摸索，筆者對(duì)提取溶劑（乙醇、甲醇、水），提取方法（超聲、加熱回流），提取時(shí)間（40min、50min、60min）對(duì)比考察發(fā)現(xiàn)，以甲醇為提取溶劑，超聲50min的提取效果最簡便高效，樣品濃度高，液相色譜出峰多。此外，在相同梯度洗脫模式下，采集55min內(nèi)獲得的指紋圖譜，對(duì)比甲醇-水、乙睛-水、甲醇-醋酸溶液、乙睛-醋酸溶液4個(gè)系統(tǒng)的流動(dòng)相。結(jié)果以乙睛-0.5%醋酸溶液梯度洗脫效果最好，各色譜峰基本達(dá)到基線分離、保留時(shí)間適中、分離度符合要求，圖譜指紋性強(qiáng)，有利于分析。

盆炎凈膠囊中含有多味中藥材，測定1個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)成分往往具有局限性，不能充分反映其整體質(zhì)量，因此建立系統(tǒng)的、全面的特征性指紋圖譜，結(jié)合聚類分析和主成分分析是評(píng)價(jià)和控制其質(zhì)量的有效方法。本研究所建立HPLC指紋圖譜方法簡便、快速、重現(xiàn)性良好，可為盆炎凈膠囊的整體質(zhì)量控制提供一定的參考。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].2015版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：193，158，224.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn).盆炎凈膠囊標(biāo)準(zhǔn)YBZ07682006[S].2006.

[3]袁志鷹，楊巖濤，李榮東，等.HPLC同時(shí)測定盆炎凈膠囊中3種有效成分含量[J].中國中醫(yī)藥信心雜志，2017，24（5）：82-85.

[4]陳勇，蔣慧蓮，周建良，等.HPLC法測定盆炎凈膠囊中芍藥苷的含量[J].西北藥學(xué)雜志.206，21（5）：207-208.

[5]劉東方，趙麗娜，李銀峰，等.中藥指紋圖譜技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J]中草藥，2016，47（22）：4085-4094.

[6]林源，稱敏.小兒柴桂退熱顆粒的UPLC指紋圖譜及聚類、主成分分析[J]. 中國藥房，2018，29（4）：474-477.

[7]馮華，劉亮，王祥培，等.黔產(chǎn)苗藥對(duì)坐葉藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2019，30（2）：232-235.

[8]明凱利，向陽，楊艷霞，等.小金膠囊的HPLC指紋圖譜建立及主成分分析[J].中國藥房，2019，30（2）： 188-192.

[9]馮華，王祥培，王世俊，等.辣椒藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析[J].中國藥房，2019，30（8）：1078-1082.

[10]馮華，聶明華，羅秀瓊，等.土知母藥材及其混淆品HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)2014，20（6）：67-69.

[11]馮華，羅秀瓊，石尚友，等. 銀翹解毒片高效液相色譜指紋圖譜識(shí)別研究[J].甘肅中醫(yī)藥學(xué)報(bào)2016，33（6）：43-46.

[12]朱星宇，陳勇強(qiáng). SPSS多元統(tǒng)計(jì)分析方法及應(yīng)用[M]. 北京：清華大學(xué)出版社，2005：241-247.

（收稿日期：2019-12-16?編輯：陶希睿）