余苣降酸茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

鄭江萍，張志權(quán)，吉慧敏，黃良永

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，十堰 442000)

余苣降酸茶是我院根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方研制的中藥袋泡茶，具有利尿消腫、清熱涼血、通經(jīng)活絡(luò)、疏散風(fēng)熱之功效，主要用于高尿酸血癥所致痛風(fēng)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及無(wú)癥狀型高尿酸血癥。余苣降酸茶處方由余甘子、菊苣、粉葛、桑葉、淡竹葉5味中藥組成，處方中余甘子為君藥，具有清熱涼血、消食健胃、生津止渴功效；菊苣和粉葛為臣藥，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫和解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒之功效；桑葉和淡竹葉為輔助藥物，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目和清熱瀉火、除煩止渴、利尿通淋之功效[1]。該制劑為新開(kāi)發(fā)制劑，為控制該制劑質(zhì)量，筆者參考文獻(xiàn)[2-7]，依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中茶劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)該茶劑性狀、水分、裝量差異、微生物限度進(jìn)行常規(guī)檢查，對(duì)桑葉和淡竹葉進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別，對(duì)余甘子和粉葛藥材的指標(biāo)成分沒(méi)食子酸和葛根素采用高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行定性和定量測(cè)定，并對(duì)其制備工藝進(jìn)行考察。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DIAON U3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司，四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、柱溫箱)；Chromeleon色譜工作站；Waters SunFire C18色譜柱(美國(guó)WATERS公司，4.6 mm×250 mm，5 μm)；KM3400超聲波提取儀(廣東科盟儀器廠(chǎng)，可調(diào)功率)；AUW120D電子分析天平(日本島津公司，感量：0.01 mg)；FA-2004電子分析天平(上海精密儀器，感量：0.1 mg)；MAC50/1/NH紅外水分測(cè)定儀(歐盟波蘭RADWAG Wagi Elektroniczne)。

1.2試藥 沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201204，含量：89.9%)；葛根素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-201313，含量：100%)；余甘子、菊苣藥材由湖北清大藥業(yè)科技有限公司提供(批號(hào)：170301)；粉葛、桑葉、淡竹葉由湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司提供(批號(hào)分別為：20170907，2180301，20170801)，藥材由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室葉方副教授鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定；余苣降酸茶(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，規(guī)格：每袋5 g，批號(hào)：20180521，20180718，20180922)；乙腈(美國(guó)TEDIA公司，色譜純)；水為超純水；甲醇、三氯甲烷、石油醚、甲苯、乙酸乙酯、甲酸均為分析純；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司，批號(hào)：20170917)。

2 方法與結(jié)果

2.1處方 余甘子、菊苣、粉葛、桑葉、淡竹葉各200 g。

2.2制備 將處方藥材以水快速搶洗，流通蒸汽滅菌30 min，混干，粉碎成粗粉，過(guò)篩，混勻，分裝成每袋5 g。

2.3質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.3.1性狀和檢查 性狀：本品為灰棕色粉末，味微苦；水分檢查[1]：依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則水分測(cè)定操作方法測(cè)定，≤12.0%。測(cè)得結(jié)果均符合規(guī)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

微生物限度檢查[1]：依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版通則四部“微生物限度”檢查法檢查，需氧菌總數(shù)≤10-4cfu·g-1，真菌和酵母菌數(shù)≤10-2cfu·g-1，不得檢出大腸埃希菌(1 g)，不得檢出沙門(mén)氏菌(10 g)，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)<102cfu·g-1。測(cè)定結(jié)果均無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.3.2鑒別 桑葉的TLC鑒別[1]：取本品粉末5 g，加石油醚(60～90 ℃)30 mL，加熱回流30 min，棄去石油醚液，藥渣揮干石油醚，加乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)訜崴?0 mL，60 ℃攪拌使溶解，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含桑葉的處方量其他藥材，按制備工藝制備缺桑葉的陰性樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。另取桑葉對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5：2 ：1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于紫外燈(波長(zhǎng)365 nm)檢視，3批供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無(wú)相同顏色斑點(diǎn)。

淡竹葉的TLC鑒別[8]：取本品粉末2.5 g，加純化水50 mL，加熱煮30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)尤燃淄?0 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液水浴濃縮至1 mL，作為供試品溶液；取不含淡竹葉的處方量其他藥材，按制備工藝制備陰性樣品，并按上述供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。另取淡竹葉對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(19：1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(波長(zhǎng)254 nm)下檢視，3批供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)；陰性樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無(wú)相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

表1 余苣降酸茶水分測(cè)定結(jié)果

Table.1DeterminationresultsofwatercontentinYujujiangsuantea%

批號(hào)第1次第2次平均值201805214.024.064.04201807183.893.853.87201809224.134.114.12

裝量差異[1]：依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則“裝量差異檢查法”操作方法測(cè)定。測(cè)得結(jié)果均符合規(guī)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

余甘子和粉葛的鑒別：在含量測(cè)定項(xiàng)下，3批供試品溶液色譜圖中沒(méi)食子酸和葛根素色譜峰的保留時(shí)間和對(duì)照品溶液色譜圖中的保留時(shí)間一致；而且缺余甘子的陰性樣品溶液色譜圖中無(wú)相應(yīng)沒(méi)食子酸色譜峰，缺粉葛的陰性樣品溶液色譜圖中無(wú)相應(yīng)的葛根素色譜峰。

表2 余苣降酸茶裝量檢查結(jié)果

Table.2InspectionresultofthequantityofYujujiangsuanteag

批號(hào)12345678910平均裝量201805215.004.995.024.984.965.005.015.105.054.985.01201807184.985.025.125.104.995.115.064.955.075.195.06201809225.034.894.925.105.095.184.955.205.135.085.06

2.3.3余甘子和粉葛的含量測(cè)定 色譜條件：Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A：0.2%磷酸溶液，流動(dòng)相B：乙腈，按表3進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm；柱溫30 ℃；流速1.00 mL·min-1。

圖1 薄層色譜圖(1.供試品，批號(hào)：20180521；2.對(duì)照藥材；3.陰性樣品)

Fig.1TLC(1.sample：20180521;2.medicinalmaterialsreference;3.negativesample)

對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品(89.9%)101.4 mg置于50 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得1.823 2 mg·mL-1沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品31.38 mg，置于50 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得0.627 6 mg·mL-1葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取沒(méi)食子酸和葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL，置于同一20 mL量瓶，用甲醛稀釋至刻度，混勻，即得對(duì)照品混合溶液。

表3 梯度洗脫表

供試品溶液的制備：精密稱(chēng)定余苣降酸茶粉末5 g，加70%甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，回流30 min，放置至室溫后，用甲醇補(bǔ)充丟失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液的制備：按原處方量和工藝制備缺余甘子的降酸茶，按“供試品溶液的制備”方法制備陰性對(duì)照溶液Ⅰ(缺余甘子)。按原處方量和工藝制備缺粉葛的降酸茶，按“供試品溶液的制備”方法制備陰性對(duì)照溶液Ⅱ(缺粉葛)。

色譜系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：取對(duì)照品混合溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀。在規(guī)定色譜條件下，供試品溶液在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置有沒(méi)食子酸峰和葛根素峰，二成分峰與其相鄰峰完全分離，理論板數(shù)以葛根素峰計(jì)均>4 000；且陰性對(duì)照溶液Ⅰ中無(wú)相應(yīng)沒(méi)食子酸峰，陰性對(duì)照溶液Ⅱ中無(wú)相應(yīng)葛根素峰；其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液和葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液各10.0，5.0，2.5，1.0，0.5 mL置于同一20 mL量瓶，混合均勻，用甲醇定量稀釋成含沒(méi)食子酸911.6，455.8，227.9，91.2，45.58 μg·mL-1，含葛根素313.8，156.9，78.45，31.38，15.69 μg·mL-1系列混合對(duì)照品溶液，精密量取5 μL，注入高效液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，經(jīng)線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：Y沒(méi)食子酸=0.003 7X沒(méi)食子酸+0.016 7，R2=0.999 3，線(xiàn)性范圍45.58～911.6 μg·mL-1；Y葛根素=0.005 6X葛根素+0.005 2，R2=0.999 3，線(xiàn)性范圍15.69～313.8 μg·mL-1。在線(xiàn)性范圍內(nèi)，二者進(jìn)樣濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液Ⅰ；D.陰性對(duì)照溶液Ⅱ；1.沒(méi)食子酸；2.葛根素

精密度實(shí)驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液5 μL，在規(guī)定色譜條件下，連續(xù)平行進(jìn)樣6次，記錄沒(méi)食子酸和葛根素的峰面積，計(jì)算6個(gè)峰面積值RSD值，沒(méi)食子酸、葛根素峰面積RSD分別為1.575%、0.179%，表明分析方法精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一批(批號(hào)：20180521)樣品，按規(guī)定供試品溶液制備方法平行制備供試品溶液6份，分別取5 μL進(jìn)樣，記錄兩種成分峰面積，并計(jì)算峰面積RSD值。結(jié)果沒(méi)食子酸峰面積平均值為111.279 2，RSD為0.98%；葛根素峰面積平均值21.542 6，RSD為1.16%，表明測(cè)定方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一批(批號(hào)：20180521)樣品，按照規(guī)定供試品溶液制備方法制成供試品溶液，在室溫下放置1，6，12，24 h，分別測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算得沒(méi)食子酸和葛根素峰面積RSD分別為0.55%，0.67%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱(chēng)取同一批(批號(hào)：20180718)樣品0.5 g，共6份，分別精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品5.5 mg、葛根素對(duì)照品2.0 mg，加入70%甲醇溶液10 mL，按照規(guī)定供試品溶液的制備方法，制備樣品并測(cè)定沒(méi)食子酸和葛根素的峰面積，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量和回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

樣品含量測(cè)定：取3批樣品，按規(guī)定供試品溶液制備方法制成樣品溶液，在規(guī)定色譜條件下，分別取對(duì)照品混合溶液(含沒(méi)食子酸455.8 μg·mL-1、葛根素156.9 μg·mL-1)和樣品溶液5 μL，進(jìn)樣，測(cè)定兩種成分峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算沒(méi)食子酸、葛根素含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

在篩選色譜條件時(shí)，流動(dòng)相采用0.2%磷酸溶液-乙腈(95：5)等度洗脫，沒(méi)食子酸、葛根素與相鄰雜質(zhì)分離不理想；采用梯度洗脫，流動(dòng)相極性由強(qiáng)到弱(乙腈比例由5%增大到70%)，使2種成分與相鄰色譜峰完全分離，取得較為理想的結(jié)果。沒(méi)食子酸的最大吸收波長(zhǎng)為273 nm，葛根素的最大吸收波長(zhǎng)為254 nm。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)254和273 nm進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示273 nm波長(zhǎng)可兼顧2種被測(cè)成分的最大靈敏度，故采用273 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表4 沒(méi)食子酸和葛根素加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table.4Experimentalresultsofrecoverytestongallicacidandpuerarin

成分取樣量/g樣品量加入量測(cè)得量mg加樣回收率平均回收率RSD%沒(méi)食子酸0.650 95.165.5410.4695.670.652 25.175.5710.6197.670.649 55.155.5610.5396.760.643 55.105.5910.95104.650.649 85.155.6211.00104.090.653 85.185.5610.96103.96100.474.16葛根素0.650 92.041.883.8194.150.652 22.041.853.7994.590.649 52.041.923.8091.670.643 52.022.164.21101.390.649 82.042.104.0997.620.653 82.052.023.9393.0795.413.70

表5 沒(méi)食子酸和葛根素含量測(cè)定結(jié)果

Table.5Contentdeterminationofgallicacidandpuerarinn=3，mg·g-1

樣品批號(hào)沒(méi)食子酸葛根素20180521 含量8.093.04 RSD/%1.471.9020180718 含量7.933.14 RSD/%0.940.4920180922 含量7.793.29 RSD/%0.530.18

在樣品溶液制備時(shí)，分別采用50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、100%水作為提取溶媒，采用超聲和回流提取方法，采用0.5，1，1.5 h不同提取時(shí)間，進(jìn)行單因素優(yōu)化，比較提取效果，結(jié)果表明70%甲醇回流0.5 h提取效果最好。

根據(jù)3批樣品含量測(cè)定結(jié)果，以沒(méi)食子酸和葛根素含量平均值的80%作為最低含量限度來(lái)控制成品中2組分的含量，即每克樣品中沒(méi)食子酸、葛根素含量分別不得低于6.36和5.53 mg。