龍血素B在模擬失重效應大鼠體內(nèi)的分布研究

郭晶晶， 李玉娟， 陳博， 康麗婷， 王識博， 李勇枝，王佳平， 高建義

(1.北京理工大學 生命學院，北京 100081； 2.中國航天員科研訓練中心，北京 100094 )

空間環(huán)境中存在失重、強輻射、噪聲、晝夜節(jié)律混亂等不利因素[1-3]. 上述有害因素明顯影響航天員骨骼、肌肉、心血管、內(nèi)分泌和神經(jīng)等系統(tǒng)的正常生理功能[4-5]. 許多國家都在尋找有效對抗措施、積極開發(fā)防治藥物，以保護航天員的身心健康[6-8].

近年來，以整體綜合調(diào)節(jié)為特色的傳統(tǒng)中藥在中國載人航天醫(yī)學領域中表現(xiàn)出了巨大的應用潛力，如用于改善空間環(huán)境下機體心血管功能的太空養(yǎng)心方[9]，以及用于防治骨質(zhì)疏松的強骨抗痿方等[10]. 龍血竭為傳統(tǒng)名貴傣藥，是百合科龍血樹屬劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen分泌的樹脂[11]，其具有活血化瘀[12-13]、定痛止血[14]等藥理作用. 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)龍血竭對空間輻射以及模擬失重效應造成的心血管和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等有顯著保護作用[15-18]. 龍血竭富含黃酮類、甾體、萜類等活性成分[19-20]，其中龍血素B (Loureirin B, LB)屬二氫查爾酮類化合物，常用作龍血竭的質(zhì)量控制指標，具有良好的活血化瘀[21]、鎮(zhèn)痛[22]等作用.

失重造成的體液頭向轉(zhuǎn)移、體液容量及體液循環(huán)變化可能改變藥物在機體內(nèi)的動態(tài)過程(吸收、分布、代謝和排泄)，影響藥物進入體循環(huán)的總量、血藥濃度和半衰期等，進而影響藥物的有效性和安全性. 迄今失重環(huán)境下的藥物分布研究較為少見，本研究建立大鼠尾懸吊模型，比較龍血素B在正常重力與模擬失重效應大鼠體內(nèi)的組織分布差異，探討模擬失重效應對藥物分布的潛在影響，有望為龍血竭在載人航天中的應用提供基礎數(shù)據(jù)支持.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠12只(體重200±20 g)，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心提供，許可證號SCXK-(京)2009-0017，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水攝食，實驗前適應性飼養(yǎng)1 w.

1.2 實驗儀器

ME204E型電子天平(瑞士Mettler公司)、Eppendorf Centrifuge 5417R型離心機(德國Eppendorf公司)、ULTra-80 ℃型低溫冰箱(美國Thermo科技公司)、1290型超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、6460型三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)、WH-3微型旋渦混合儀(上海滬西儀器廠).

1.3 實驗試劑

LB、大黃酸 (內(nèi)標, internal standard, IS)對照品，化學結構見圖1，購于中國食品藥品檢定研究院. 甲基叔丁基醚 (MTBE)、甲醇、乙腈為色譜純，購于美國Fisher公司. 其余試劑均為分析純.

2 方 法

2.1 模型建立與樣本收集

大鼠適應性飼養(yǎng)1 w后隨機分為2組，每組6只：分為正常重力組(normal gravity group, NG)和模擬失重效應組 (simulated microgravity group, SMG). NG大鼠飼養(yǎng)于普通鼠籠中，SMG大鼠采用Morey-Holton尾懸吊方法建立模擬失重效應模型：將大鼠置于吊尾籠，尾部懸吊于籠頂，前肢踏于籠底，使大鼠頭低位，軀干與鼠籠的水平面呈30°，后肢自由懸空不負重，大鼠可在籠內(nèi)自由活動，飲水攝食[23]. 動物飼養(yǎng)與實驗均遵照北京理工大學實驗動物飼養(yǎng)和使用規(guī)定進行. 大鼠飼養(yǎng)21 d后，禁食12 h，自由飲水，然后以25 mg/kg劑量灌胃LB，1 h后麻醉、心臟灌流并處死，取肝、腸、腦、心、脾、腎、肺、胃、睪丸和骨骼肌10種臟器組織用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱中避光保存待測.

2.2 對照品儲備液、工作曲線及質(zhì)控樣本制備

精密稱取適量LB、IS對照品，分別用色譜甲醇溶解定容制得1.0 mg/mL的儲備液. 再用甲醇稀釋成7.81～1 000.00 ng/mL的LB系列對照品溶液、1 μg/mL的IS對照品溶液，置于4 ℃冰箱避光存放. 取空白肝臟等組織適量，加入2倍體積預冷的生理鹽水在玻璃勻漿器中制成勻漿，10 kg離心10 min，取上清得空白基質(zhì). 取空白基質(zhì)50 μL加入LB溶液50 μL，制成終濃度依次為7.81，15.62，31.25，62.50，125.00，250.00，500.00，1 000.00 ng/mL的工作曲線系列溶液. 取各空白組織基質(zhì)(肝、腸等)分別加入LB溶液50 μL，制成終濃度為7.81，125.00和800.00 ng/mL的低、中、高濃度質(zhì)量控制(quality control, QC) 樣本.

2.3 樣本預處理

取肝、腸等待測組織適量，加入2倍體積預冷的生理鹽水在玻璃勻漿器中制成勻漿，10 kg離心10 min. 取上清50 μL，依次加甲醇50 μL和IS溶液10 μL，渦旋混合10 s，再加入MTBE 400 μL后室溫充分振蕩5 min，10 kg離心10 min. 取有機層于40 ℃氮氣流下吹干，加入甲醇100 μL復溶，5 kg離心2 min，取上清待分析.

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜分離方法參考文獻[24]并加以改進，色譜柱采用Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm, 5 μm填料)，柱溫為室溫. 流動相為A：水(含5 mmol/L甲酸銨)，B：乙腈. 流速設置為0.2 mL/min，進樣量10 μL，采取梯度洗脫，洗脫程序：0 min 10 % B，0～0.5 min 10 % B，0.5～1.5 min 10 % ～90 % B，1.5～2.5 min 90 % B，2.5～3.5 min 90 % ～ 10 % B，3.5～5min 10 % B，5 min 停止.

質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源，負離子檢測模式. 質(zhì)譜參數(shù)參考前期研究設置[24]：離子源噴射電壓3 500 V；干燥氣溫度250 ℃；碰撞氣、鞘氣、輔助氣為氮氣；霧化器、加熱器、干燥器壓力分別為60，55，20 psi；毛細管出口電壓LB 142 V、IS 89 V；碰撞能量LB 39 eV、IS 15 eV；多反應檢測離子對為LB 315.1→92.0、IS 255.1→240.1.

2.5 方法學驗證

根據(jù)美國FDA生物樣品分析方法指南，對上述分析方法的專屬性、標準曲線、準確度與精密度、回收率和穩(wěn)定性進行考察和確證[25].

專屬性：將10種組織空白基質(zhì)、添加LB和IS的空白基質(zhì)、各實際組織樣本進樣分析，得到各自色譜圖，用以考察LB和IS的分離度及內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾LB和IS的測定.

標準曲線：以LB和IS的峰面積比值為縱坐標，LB濃度為橫坐標，進行加權最小二乘法回歸運算，求得回歸方程和相關系數(shù).

準確度與精密度：取各基質(zhì)不同濃度QC樣本進行分析，以當日的標準工作曲線計算LB濃度，重復3次得到日內(nèi)精密度和準確度；連續(xù)測定3 d，計算方法的日間精密度和準確度. 準確度用相對誤差(RE)表示，精密度用相對標準偏差(RSD)表示.

回收率與穩(wěn)定性：取各基質(zhì)QC樣本，測LB色譜峰面積，與相同濃度的LB對照品溶液峰面積進行比較，計算方法的回收率. 取各濃度的QC樣本，測定LB濃度，然后分別置于室溫24 h、3次凍融循環(huán) (-20 ℃) 和低溫保存 (-80 ℃)一個月的環(huán)境中，再次測定LB濃度，計算2次結果的相對誤差(RE)，以考察方法的穩(wěn)定性.

2.6 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件(美國IBM公司)進行統(tǒng)計處理，結果以均值±標準差表示，組間差異采用獨立樣本t檢驗分析，p<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義.

3 結果與討論

3.1 方法學確證

3.1.1專屬性

分別取各空白組織基質(zhì)、添加LB和IS的各空白組織基質(zhì)、待測的實際樣本進行HPLC-MS/MS分析，得到各自色譜圖. 結果顯示LB和IS的保留時間約為2.61和2.68 min，組織內(nèi)源性物質(zhì)不干擾LB和IS的測定. 圖2列出空白肝組織、添加LB和IS的空白肝組織、大鼠給藥1 h后肝組織樣本的代表性色譜圖.

3.1.2標準曲線

如表1所示，各基質(zhì)中LB在7.81～1 000.00 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性相關，相關系數(shù)r2均大于0.996.

表1 各基質(zhì)中LB線性范圍、回歸方程及相關系數(shù)

Tab.1 Calibration range, regress equation and correlation coefficient in biological matrices

生物樣本線性范圍/ (ng·mL-1)回歸方程相關系數(shù)r2肝7.81 ～1 000.00y=383.1x-21.110.996 0腦7.81 ～1 000.00y=389.2x-10.490.999 7腸7.81 ～1 000.00y=384.8x-8.7770.999 5心7.81～1 000.00y=265.0x-14.630.998 0腎7.81 ～1 000.00y=332.6x+1.7370.998 0胃7.81～1 000.00y=329.3x-3.0940.999 6肺7.81 ～1 000.00y=349.4x-11.670.999 7睪丸7.81～1 000.00y=378.7x+0.6260.998 1骨骼肌7.81 ～1 000.00y=318.4x-2.4670.999 1脾7.81～ 1 000.00y=437.1x-12.470.999 8

3.1.3準確度與精密度

各基質(zhì)中LB日內(nèi)與日間準確度RE均在±10%以內(nèi)，精密度RSD均小于15.0 %，表明該方法準確、可靠、重現(xiàn)性好，符合生物樣品分析方法指導原則的要求[25].

3.1.4回收率與穩(wěn)定性

LB在各基質(zhì)中的萃取回收率均大于90%，在室溫放置24 h、-20 ℃ 3次凍融循環(huán)和- 80 ℃保存一個月后的相對誤差RE均在±8%以內(nèi)，符合生物樣品分析方法指南的規(guī)定[25]. 結果表明，樣本在以上儲存條件下穩(wěn)定，分析結果可靠.

3.2 LB的組織分布

按2.1和2.2節(jié)的實驗操作處理實際樣本后，進行HPLC-MS/MS分析. 如圖3所示，LB在NG組大鼠肝、胃組織中的質(zhì)量分數(shù)分別為4.3±0.9和3.3±0.7 μg/g，在大鼠腸、腎、心、脾、骨骼肌、睪丸、肺和腦組織中的質(zhì)量分數(shù)分別為246.7±42.6，157.9±15.1，114.2±41.2，53.9±29.1，51.6±20.0，32.0±3.0，18.7±8.7，12.4±8.2 ng/g. 肝、胃中質(zhì)量分數(shù)明顯高于其他組織，然后依次是腸>腎>心>脾>骨骼肌>睪丸>肺>腦，腦中最少. LB在SMG組大鼠肝和胃中質(zhì)量分數(shù)是6.3±0.6和3.4±0.5 μg/g，在腸、腎、心、脾、骨骼肌、睪丸、肺及腦組織中的質(zhì)量分數(shù)為116.6±16.1，123.1±26.9，105.2±15.8，48.0±10.9，63.8±13.8，46.0±12.6，18.0±4.0，79.7±33.8 ng/g. 與NG組相比，LB在SMG組大鼠肝中質(zhì)量分數(shù)升高47.7%(p<0.05)，在腦中質(zhì)量分數(shù)上升了5.4倍(p<0.05)；在大鼠腸和腎中質(zhì)量分數(shù)顯著下降(p<0.05)，分別下降了52.7%及22.0%；在大鼠胃、心臟、肺、睪丸、骨骼肌中質(zhì)量分數(shù)變化無顯著性差異.

4 結 論

藥物在體內(nèi)的分布受到多種因素的影響，除了與藥物自身的性質(zhì)有關外，還與組織的血液循環(huán)、藥物-組織的親和力和機體生理狀態(tài)等密切相關[26]. LB在各組織中的質(zhì)量分數(shù)結果顯示，LB在肝、胃的質(zhì)量分數(shù)較高，腎、腸、心、脾、骨骼肌、肺次之，腦中最少，多集中分布于血流量豐富的組織，如肝、腎、腸等. LB在腦組織中的質(zhì)量分數(shù)較低，或許是由于血腦屏障這一特殊結構的存在限制了LB向腦組織中轉(zhuǎn)運，導致LB在腦中分布較少. 肝臟是血流量較豐富的器官，可能使LB在此處較多分布. 骨骼肌相比其他組織器官血管分布較少，可能導致LB在骨骼肌中分布較少.

與NG組相比，LB在SMG組大鼠肝中的分布明顯增加. 肝血流量豐富，受血液循環(huán)的影響較大，在失重或模擬失重狀態(tài)下，重力消失導致體液頭向轉(zhuǎn)移，肝中的血液量可能發(fā)生改變，使LB在肝中分布增多；同時課題組內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)模擬失重效應改變大鼠肝中部分藥物代謝酶的表達或活性[27]，可能使LB在肝中的代謝減少，導致LB在模擬失重效應大鼠肝中質(zhì)量分數(shù)上升. 上述2種可能也許是LB在模擬失重效應大鼠肝中分布增多的原因. SMG組大鼠腦中LB質(zhì)量分數(shù)升高，或許與血腦屏障結構改變有關. 本課題組研究發(fā)現(xiàn)模擬失重效應下大鼠血腦屏障的通透性增加，血腦屏障上部分外排蛋白(如：P-糖蛋白)表達或功能發(fā)生改變[28]，有可能導致LB在腦中分布增多，但具體機制仍待進一步研究. LB在SMG組大鼠腸中的分布顯著減少. 據(jù)相關文獻報道，失重模型下大鼠腸系膜小靜脈網(wǎng)的血流阻力減少[29]，下半身/后半身動脈萎縮[30]等，均有可能造成腸道的血流量或血流速度改變，導致腸中的LB量下降. 另課題組內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重效應大鼠腸道藥物代謝酶或藥物轉(zhuǎn)運外排蛋白(如：P-糖蛋白)的表達和活性發(fā)生變化，也有可能是改變LB在腸中分布的原因.

本課題組曾對LB在模擬微重力效應大鼠體內(nèi)的藥物動力學進行了研究，結果顯示：與NG組相比，LB在SMG組大鼠體內(nèi)的藥時曲線下面積AUC0-t、達峰濃度Cmax和生物利用度F皆降低，說明LB進入機體血液循環(huán)的總量減少[24,31]. 但LB在SMG組大鼠肝中分布較NG組增多，這種現(xiàn)象或許與SMG組大鼠肝中代謝LB的代謝酶表達量或活性變化有關[32]. 目前常見LB在血瘀血栓和疼痛模型中發(fā)揮較好的活血化瘀和鎮(zhèn)痛作用報道[21-22]，尚無在模擬微重力效應大鼠體內(nèi)的藥效研究. 課題組前期研究表明龍血竭對模擬微重力效應導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有明顯的保護作用[32]，推測可能與龍血竭有效成分LB在SMG組大鼠腦中分布增加相關. LB在SMG大鼠體內(nèi)的藥動學、生物利用度、藥效與組織分布的關系還需深入研究.

本文首次對LB在正常重力和長期模擬失重效應大鼠體內(nèi)的組織分布進行了研究，發(fā)現(xiàn)LB的分布具有組織特異性，且模擬失重效應會顯著影響LB在大鼠體內(nèi)的分布過程. 該結果為失重條件下的藥物分布研究提供基礎數(shù)據(jù)，而失重條件下的藥物分布機制有待進一步研究.