氣相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量

張雪，張麗茹，王為，蔡冬冬，張筠*

1. 黑龍江東方學院食品與環(huán)境工程學部（哈爾濱 150066）；2. 呼倫貝爾雙娃乳業(yè)有限公司（呼倫貝爾 162750）

由于個人、社會等多方面外界因素的影響，許多地區(qū)出現(xiàn)了母乳喂養(yǎng)量缺乏、營養(yǎng)缺乏以及母乳喂養(yǎng)條件缺乏等情況，因此對母乳替代品——嬰兒配方奶粉的研究備受重視[1]。嬰兒配方奶粉中脂肪酸組成較牛乳更接近于人乳，但不能完全替代人乳，那么生產(chǎn)脂肪母乳化嬰兒配方奶粉已成為乳品行業(yè)急待解決的重要問題[2]。1, 3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯（簡稱OPO）現(xiàn)已經(jīng)證實具有促進鈣吸收和利用、促進嬰兒發(fā)育、減少便秘和產(chǎn)梗阻發(fā)生的功能[3-6]，所以近年來被廣泛應(yīng)用于保健食品、嬰幼兒配方乳粉等領(lǐng)域。

中國人民共和國衛(wèi)生部于2008年發(fā)布的第13號公告中，批準1, 3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯（簡稱OPO）作為營養(yǎng)強化劑使用在嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品中[7]，并于2010年第1號公告中擴大其使用范圍及使用量[8]。

目前，國內(nèi)還沒有建立關(guān)于檢測嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的標準。國內(nèi)外對于OPO的檢測方法主要有氣相色譜法[9-12]、液相色譜法[13-18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-20]等，其中高效液相色譜法[21]是目前較廣泛的方法，但使用的銀離子色譜柱的穩(wěn)定性差，柱子的使用率太低且壽命短，測定時間較其他方法長，回收率欠佳，并不適用于OPO的分離測定。結(jié)合實際情況，氣相色譜法使用并不普遍，現(xiàn)有文獻中的方法也并沒有對方法進行深入研究，但氣相色譜法較為穩(wěn)定，測定的結(jié)果普遍準確且含量較高，因此試驗擬建立一種測定乳粉中OPO含量的方法，旨在得到一種重現(xiàn)性好、精密度高且回收率高、結(jié)果準確的方法，使其越來越多地被應(yīng)用到嬰幼兒配方乳粉中OPO的定量檢測中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25%氨水（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；無水乙醇（色譜純，瑞典Oceanpak公司）；無水乙醚（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；石油醚（優(yōu)級純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；正己烷（德國Merck公司）；OPO標準物質(zhì)（美國Sigma公司）；十七烷酸甘油三酯標準物質(zhì)（美國NU-CHEK公司）；剛果紅指示劑（濃度10 g/L）；氮氣；氫氣（純度≥99.995%）；氧氣；0.22 μm尼龍濾膜（有機相）：上海安普生物科技有限公司；DB-1HT色譜柱（30 m×0.25 mm×0.1 μm，Agilent Technologies公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

7890（FID）型氣相色譜儀：Agilent Technologies公司；BT 125 D型電子天平（德國Sartorius公司）；TST-UPB-20型超純水機（泰斯特儀器有限公司）；KQ 3200 DE型數(shù)控沖超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DKS-2型電熱恒溫水浴鍋（泰斯特儀器有限公司）；XW-80 A型旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；RE-52 AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SPB-3全自動空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；SPH-300 A氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

OPO溶液（1 mg/mL）：準確稱取25 mg OPO標準物質(zhì)，用正己烷定容至25 mL并使其充分溶解，在4 ℃條件下儲存。

十七烷酸甘油三酯內(nèi)標溶液（2.5 mg/mL）：準確稱取62.5 mg十七烷酸甘油三酯標準物質(zhì)，用正己烷定容至25 mL并使其充分溶解，在4 ℃條件下儲存。

混合標準工作液：準確移取100，200，300，400和500 μL OPO溶液，每份準確加入100 μL十七烷酸甘油三酯內(nèi)標溶液，用正己烷定容至1 mL。其中OPO質(zhì)量濃度為100，200，300，400和500 μg/mL，十七烷酸甘油三酯內(nèi)標溶液質(zhì)量濃度為250 μg/mL。

1.3.2 前處理條件優(yōu)化

1.3.2.1 樣品前處理步驟

試驗選用已知OPO含量的奶粉進行測定，奶粉中的OPO含量是已知且穩(wěn)定的，理論值為4.50±0.05 g/100 g。準確稱取1.0 g（精確至0.000 1 g）樣品，加入10 mL 65 ℃的超純水，使其溶解，置于毛氏抽脂瓶中；加入35%的氨水，在一定溫度下水解15 min；加入10 mL 95%無水乙醇以及2滴剛果紅指示劑，再加入一定量的乙醚與石油醚；將合并后的有機相用無水硫酸鈉脫水，在65 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至完全蒸干；將剩余的油脂用正己烷定容至25 mL，取2 mL上述液和1 mL內(nèi)標溶液，用正己烷定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，即為待測液。

1.3.2.2 堿水解液用量的選擇

氨水溶液體系的加入可以破壞乳的膠體性以及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨水溶液體系中，而脂肪游離出來，參考GB 5009.6—2016第三法[22]，選用1，2和3 mL的體積來判斷氨水加入量對最終結(jié)果的影響。1.3.2.3 水解溫度的選擇

水解溫度會直接影響堿水解液溶解脂肪的速度，但水解時間相差太短并不能對結(jié)果產(chǎn)生顯著的影響，因此對水解溫度進行優(yōu)化，試驗選擇室溫23 ℃與水浴65 ℃來判斷水解溫度對最終結(jié)果的影響。

1.3.2.4 萃取劑用量的選擇

乙醚與石油醚作為萃取脂肪的萃取劑，其用量直接影響到脂肪的提取率。因此對萃取劑用量進行優(yōu)化，選用以下兩種方式來判斷萃取劑用量對最終結(jié)果的影響：

1) 加入25 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入25 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉(zhuǎn)入雞心瓶中，再加入5 mL 95%無水乙醇，加入15 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入15 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉(zhuǎn)入雞心瓶中，最后加入15 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入15 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉(zhuǎn)入雞心瓶中。

2) 加入25 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入25 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉(zhuǎn)入雞心瓶中，再重復以上步驟提取2次。

1.3.2.5 萃取劑比例的選擇

試驗采用無水乙醚與石油醚作為萃取劑，萃取劑的比例同樣影響萃取脂肪的結(jié)果，因此試驗選用無水乙醚-石油醚比例分別為1︰1，1︰2和2︰1作為選擇條件。

1.3.3 色譜條件優(yōu)化

參照馬小寧等[12]程序升溫方法進行改進。分別采用兩種程序升溫方式進行色譜條件優(yōu)化，進樣樣品為0.1 g/100 g添加內(nèi)標的OPO標準品。升溫程序（a）：初始溫度70 ℃，保持1 min，以50 ℃/min的速率升至170 ℃，再以20 ℃/min的速率升至350 ℃，保持25 min；升溫程序（b）：初始溫度100 ℃，保持1 min，以50 ℃/min的速率升至300 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升至370 ℃，保持10 min。

進樣口溫度320 ℃；檢測器溫度370 ℃；載氣為氮氣，恒壓模式；進樣量1.0 μL；燃氣流量30.00 mL/min。

1.3.4 OPO含量計算

式中：X表示試樣中OPO的含量，g/100 g；C表示試樣中OPO的濃度，mg/mL；V表示試樣的定容體積，mL；m表示試樣的質(zhì)量，mg；f表示稀釋倍數(shù)。

以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

1.3.5 方法驗證

1.3.5.1 精密度

對同一添加OPO的乳粉樣品，在相同的測定條件下進行6次重復試驗，計算OPO含量以及相對標準偏差（RSD）。

1.3.5.2 加標回收率

稱取一定量的樣品，在3個加標水平下測定OPO含量，每個水平重復測定6次，計算回收率。3個水平的添加量分別為2.4，3.4和4.4 g。

1.3.5.3 標準曲線及相關(guān)性

移取100，200，300，400和500 μL OPO溶液，每份加入100 μL十七烷酸甘油三酯溶液，用正己烷定容至1 mL。配制成OPO質(zhì)量濃度為100，200，300，400和500 μg/mL的系列溶液，對此混合標準溶液進行測定分析，以O(shè)PO含量為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線。

1.3.5.4 檢出限與定量限

稱取一定量的樣品，在相同的測定條件下進行3次重復試驗，以相當于3倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低檢出限；以相當于10倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 氨水體積的選擇

當加入1 mL氨水時，最終測得的OPO含量最高且最接近理論值，為4.36±0.02 g/100 g，最后選用1 mL氨水作為前處理最優(yōu)條件之一，樣品色譜分析圖如圖1所示。

2.1.2 水解溫度的選擇

在加入1 mL氨水的條件下，采用不同水解溫度進行試驗。由計算可知，當在65 ℃溫度下水解時，最終測得的OPO含量最高且最接近理論值，為4.45±0.03 g/100 g，最后選用在65 ℃溫度下水解作為前處理最優(yōu)條件之一，樣品色譜分析圖如圖2所示。

圖1 加入1 mL氨水樣品色譜圖

圖2 65 ℃水解樣品色譜圖

2.1.3 萃取劑用量的選擇

在加入1 mL氨水、65 ℃溫度水解的條件下，采用不同萃取劑用量進行試驗。由計算可知，當采用萃取劑用量（a）時，最終測得的OPO含量是最高的，為4.46±0.03 g/100 g，同時在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用萃取劑用量（b）時，萃取過程中會產(chǎn)生大量白色渾濁物體，沉淀不完全，導致肉眼無法觀察萃取情況，影響后續(xù)試驗操作與上機分析。綜上所述，最后選用萃取劑用量（a）作為前處理最優(yōu)條件之一，樣品色譜分析圖如圖3所示。

圖3 萃取劑用量（a）樣品色譜圖

2.1.4 萃取劑比例的選擇

試驗以不添加OPO原料的嬰幼兒配方乳粉作為基質(zhì)粉，準確稱取1 g基質(zhì)粉，向其中加入3 g OPO標準品，以無水乙醚與石油醚的比例分別為1︰1，1︰2和2︰1為變量條件測定OPO含量，每個變量重復測定6次，測得結(jié)果如表1所示。

表1 以萃取劑比例為變量試驗結(jié)果 g/100 g

基質(zhì)粉中OPO含量如圖4所示。已知基質(zhì)粉中OPO含量約為1.72 g/100 g，加入標準品后的奶粉OPO理論含量約為4.72 g/100 g。表1表明，當無水乙醚︰石油醚比例為1︰1時，測定結(jié)果最接近于最終理論值。綜合比較，選擇無水乙醚與石油醚的比例1︰1作為前處理最優(yōu)條件之一。

圖4 基質(zhì)粉OPO色譜圖

綜上所述，前處理條件的最終選擇為：氨水體積1 mL、水解溫度65 ℃、萃取劑用量（a）、無水乙醚與石油醚的比例1︰1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

程序升溫（a）色譜圖如圖5所示。采用（a）程序升溫，內(nèi)標物峰與目標峰的出峰時間均在13 min左右，內(nèi)標物峰與目標峰分離效果不理想且峰型不好，雜峰較多，無法準確定位內(nèi)標物峰與目標峰，為定量分析帶來困難。程序升溫（b）色譜圖如圖6所示。采用（b）程序升溫，內(nèi)標物峰與目標峰的出峰時間均在12 min左右，內(nèi)標物峰與目標峰分離效果理想且峰型良好，幾乎無雜峰，可以準確定位內(nèi)標物峰與目標峰，適用于測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量。

2.3 精密度測定

對同一添加OPO的乳粉樣品進行6次重復試驗，計算OPO含量并進行精密度分析，計算其相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表2。RSD值為2.57%，小于5%，表明儀器及方法的精密度與重現(xiàn)性良好，測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO具有較高的準確度。

2.4 加標回收率測定

準確稱取0.1 g樣品，依次添加3個不同水平的OPO標準品，每個水平重復測定6次，按上述試驗條件操作，計算回收率，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，加標回收率平均為92.97%±5%，可以滿足分析方法對于加標回收率的要求，可以證明采用該方法測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO具有較高的準確度，效果良好。

圖5 采用程序升溫（a）色譜圖

圖6 采用程序升溫（b）色譜圖

表2 精密度測定結(jié)果

表3 回收率測定結(jié)果

2.5 標準曲線及相關(guān)性

對不同濃度的OPO混合標準溶液進樣，進行線性回歸，結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯鰳藴是€濃度在0.1～0.5 g/100 g范圍內(nèi)，含量與峰面積線性關(guān)系最好，證明該方法響應(yīng)值與校正曲線一致度高，線性回歸方程為y=583.34x-13.858，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

圖7 OPO標準曲線

2.6 檢出限與定量限測定

以相當于3倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低檢出限為0.04 g/100 g；以相當于10倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低定量限為0.14 g/100 g。

3 結(jié)論

試驗采用氣相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中OPO的含量，通過乙醚與石油醚提取乳粉中的脂肪，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮等處理，結(jié)果表明其RSD為2.57%，回收率為92.97%±5%；在0.1～0.5 g/100 g范圍內(nèi)，R2為0.999 8，檢出限為0.04 g/100 g，定量限為0.14 g/100 g。該方法操作簡便、精密度高、回收率良好、結(jié)果準確，適用于嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的檢測。