氣相色譜測定動植物中角鯊烯含量

張協(xié)光，藍(lán)雄，彭祖茂，朱麗，李碧芳*

深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣東）（深圳 518109）

角鯊烯又名鯊烯、鯊萜，是所有細(xì)胞中甾醇的前體，不飽和程度較高，是一種重要生物活性物質(zhì)[1-2]。角鯊烯具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗心血管疾病、抗感染、提高免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[3]，因此被廣泛應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)。

鯊烯廣泛存在于動植物體內(nèi)，在動物中以深海魚類，特別是鯊魚的肝臟中含量最為豐富，在鯊魚肝油中的最高含量可達(dá)69%，在日常接觸的一些動物油脂，如平時食用的牛乳脂、豬油及牛油脂中也廣泛存在角鯊烯；而它在植物中的分布也十分廣泛[4]，在許多植物的根、葉、皮等部分都存在角鯊烯，如鼠尾草、煙葉、莧屬植物和苔蘚植物中亦含角鯊烯，植物中則以莧屬植物的種子油中有較高含量的角鯊烯，含量達(dá)到5%～8%，橄欖油和棕櫚油中含量也較高。莧屬植物的種子油有望作為潛在的角鯊烯資源。目前，角鯊烯含量的測定方法主要有高效液相色譜（HPLC）

法[5-7]、氣相色譜法[8-10]和氣質(zhì)聯(lián)用法[11-14]。由于角鯊烯的極性較小，易溶解于非極性溶劑中，而液相色譜又以反相液相色譜應(yīng)用為主，故檢出限均高于氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法而很少被應(yīng)用于分析檢測中。對于氣質(zhì)聯(lián)用法而言，其對儀器要求比較嚴(yán)格，現(xiàn)還不能普及到大多的實驗室中，故試驗采用氣相色譜法對動植物中的角鯊烯進(jìn)行分析，氣相色譜法測定中大多數(shù)采用有機(jī)溶劑溶解直接進(jìn)樣，不僅會污染色譜柱，還會縮短色譜柱的使用壽命。由于角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物，因此可將樣品經(jīng)酸水解，后用石油醚-乙醚混合試劑提取脂肪，然后進(jìn)行皂化處理，萃取凈化皂化液，從而可脫除樣品中較多的雜質(zhì)峰。試驗建立了氣相色譜測定動植物中角鯊烯含量的方法，以期對動植物中不同原料來源角鯊烯的含量分布及差異研究提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890 B配氫火焰離子化檢測器（美國Agilent公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；恒溫水浴鍋（上海-恒科技有限公司）；氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；分析天平（德國賽多利斯SARTORIUS）；組織粉碎機(jī)（北京鼎昊源科技有限公司）。

甲醇、正己烷、無水乙醇（色譜級，德國默克公司）；氫氧化鉀、氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（分析純，東莞市東江化學(xué)試劑有限公司）；乙醚、石油醚（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實驗用水為Milli-Q超純水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：角鯊烯（純度≥99%，Sigama-Aldrich）。

1.2 色譜條件

采用Agilent HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent Technologies），載氣為氮氣（純度99.999%）；空氣流速400 mL/min，氫氣流速40 mL/min，氮氣流速2 mL/min，尾吹流速30 mL/min；檢測器FID溫度300 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μ L，分流比20∶1；程序升溫：初始溫度160 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min，再以5℃/min升溫至280 ℃，保持10 min。后運行300 ℃，時間2 min。

1.3 試劑配制

鹽酸溶液（8.3 mol/L）：量取250 mL鹽酸，用110 mL水稀釋，混勻。

乙醚-石油醚混合溶液（1+1）：取等體積的乙醚和石油醚，混勻備用。

氫氧化鉀-甲醇溶液（1 mol/L）：取5.6 g氫氧化鉀溶解在100 mL甲醇中，混勻。

飽和氯化鈉溶液：稱取360 g氯化鈉溶解于1.0 L水中，攪拌溶解，澄清備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確到0.000 1 g）角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品到100 mL容量瓶，用正己烷溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。此溶液在4 ℃下可保存6個月。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

分別取0.3，1.0，2.0，5.0和10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，定容，即得到質(zhì)量濃度為3.00，10.0，20.0，50.0和100 μg/mL的系列溶液。將1 μL的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液注入氣相色譜儀中，測得相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 樣品前處理

1.5.1 試樣的制備

在采樣和制備過程中，應(yīng)避免試樣污染。固體或半固體試樣使用組織粉碎機(jī)，液體試樣用勻漿機(jī)打成勻漿，在-18 ℃下冷凍保存，分析使用時將其解凍后使用。

1.5.2 非油脂類樣品

稱取0.1～1.0 g（精確至0.1 mg，含100～200 mg脂肪）均勻試樣到100 mL具塞量筒中，加入2.0 mL乙醇和4 mL水，混勻，加入10 mL鹽酸溶液，混勻。將具塞量筒放入70～80 ℃水浴中，水解40 min。每隔10 min振蕩一下具塞量筒，確保在具塞量筒壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出具塞量筒，冷卻至室溫。

水解后的試樣，加入10 mL乙醇，混勻，然后加入50 mL乙醚-石油醚混合溶液，振搖5 min，靜置10 min。用少量的乙醚-石油醚混合溶液沖洗具塞量筒和塞子，將醚層轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中。按照以上步驟重復(fù)提取水解液3次，將3次收集的醚層合并到250 mL燒杯中。放置于水浴鍋上蒸發(fā)至干，得到試樣脂肪提取物。

1.5.3 油脂類樣品

油脂類樣品無需脂肪提取，直接按照1.5.4小節(jié)進(jìn)行皂化及甲酯化。

1.5.4 皂化及甲酯化

非油脂類樣品：將提取得到的脂肪用正己烷溶解并完全轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，用氮吹儀吹干，加入1 mL 1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，在漩渦振蕩器上振蕩2 min，后準(zhǔn)確加入5 mL正己烷，在漩渦振蕩器上萃取1 min，用飽和食鹽水洗滌至中性，靜置，使水相和正己烷相分層。取3 mL正己烷相于10 mL玻璃試管中，加入約0.3 g無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，將溶液過膜，待測。

油脂類樣品：準(zhǔn)確稱取0.1～0.5 g（精確至0.1 mg）樣品至25 mL比色管中，以后步驟同非油脂類樣品“加入1 mL 1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液……過膜，待測”。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

由于角鯊烯易溶于非極性溶劑，一般采用弱極性色譜柱即可滿足角鯊烯的分離和測定。角鯊烯是一種高度不飽和烴類化合物，分子質(zhì)量大，沸點高（280℃），難揮發(fā)，因此試驗選用非極性色譜柱HP-5耐高溫（350 ℃）低流失彈性毛細(xì)管柱。進(jìn)樣口溫度設(shè)為250 ℃，在此條件下，既可保證樣品的充分汽化，又能保證固定液無流失[15]，色譜峰的分離效果好且基線較平穩(wěn)。在此色譜條件下，角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的氣相色譜圖見圖1。該條件下，色譜峰分離、峰型較好，保留時間短，亦沒有基質(zhì)干擾定量分析。

圖1 不同樣品角鯊烯氣相色譜圖

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 油脂樣品

2.2.1.1 皂化試劑的選擇

為了選擇最佳的皂化試劑，試驗選取了2種皂化試劑，即氫氧化鉀-甲醇溶液（1 mol/L）、氫氧化鉀-乙醇溶液（1 mol/L），并以橄欖油樣品處理后角鯊烯的檢出量作為指標(biāo)，對以上2種皂化試劑進(jìn)行對比。對于橄欖油樣品，氫氧化鉀-甲醇溶液的皂化效果最佳，角鯊烯的檢出量為279±1.00 mg/100 g，而氫氧化鉀-乙醇溶液的萃取效果稍差，角鯊烯的檢出量只有256±0.577 mg/100 g，而且用飽和食鹽水洗滌至中性時，正己烷與飽和食鹽水不易分層，還有渾濁現(xiàn)象，氫氧化鉀-乙醇溶液放置時間久還會變質(zhì)變黃，故選擇氫氧化鉀-甲醇溶液為最佳的皂化試劑。

2.2.1.2 皂化時間的選擇

選取1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液為皂化試劑，考察了固定萃取時間2 min情況下不同皂化時間對角鯊烯含量的影響，皂化時間分別為1，2，3，4和5 min。按此次試驗皂化方法進(jìn)行皂化，最后GC分析檢測，得出不同皂化時間對角鯊烯含量測定的影響，結(jié)果見圖2。在所選的皂化時間段內(nèi)，不同皂化時間對角鯊烯含量測定值的影響較小。因此，從經(jīng)濟(jì)角度和成本時間考慮，選擇 2 min為最佳皂化時間。

2.2.1.3 萃取時間的選擇選取1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液為皂化試劑，考察了固定皂化時間2 min情況下不同萃取時間對角鯊烯含量的影響，萃取時間分別為0.5，1，1.5，2和3 min。按此次試驗萃取方法進(jìn)行萃取，最后GC分析檢測，得出不同萃取時間對角鯊烯含量測定的影響，結(jié)果見圖3。在所選的萃取時間段內(nèi)，不同時間對角鯊烯含量測定值的影響較小。因此，從經(jīng)濟(jì)角度和成本時間考慮，選擇1 min為最佳萃取時間。

圖2 不同皂化時間的影響

圖3 不同萃取時間的影響

2.2.2 非油脂樣品

為了選擇最佳的非油脂樣品前處理方法，試驗研究了酸水解提取脂肪再皂化和直接皂化兩種方法對角鯊烯含量影響，并以羅漢果樣品處理后角鯊烯的檢出量作為指標(biāo)，對以上2種提取方式進(jìn)行對比。酸水解提取脂肪再皂化法是將樣品經(jīng)酸水解，后用石油醚-乙醚混合試劑提取脂肪，后按照油脂樣品處理方式進(jìn)行皂化處理，測定樣品中角鯊烯含量。直接皂化方法是稱取試樣后，加入5 mL的水、10 mL的無水乙醇和10 mL 50%的氫氧化鉀水溶液，搖勻，在70 ℃搖床皂化60 min，后冷卻至室溫；用正己烷萃取3次，將3次收集的正己烷層合并到250 mL分液漏斗中，用約100 mL的水重復(fù)洗滌3次，直至正己烷層洗滌至中性（可用pH試紙檢測下層溶液pH），除去下層水相；將洗滌后的正己烷層經(jīng)無水硫酸鈉（約3 g）濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，用約15 mL正己烷沖洗分液漏斗2次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，在40 ℃水浴中減壓蒸餾，待瓶中正己烷剩下約2 mL時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹至干；準(zhǔn)確移取5 mL正己烷溶解，過膜，待測。兩種前處理方法的結(jié)果如表1所示。

結(jié)果表明，對于羅漢果樣品，采用酸水解提取脂肪再皂化的提取方式，角鯊烯的檢出量為44.6±0.577 mg/100 g，而直接皂化的提取方式，角鯊烯的檢出量僅有23.8±1.00 mg/100 g，可能是酸水解法更有利于樣品中結(jié)合態(tài)的角鯊烯游離，同時較直接皂化反應(yīng)步驟少，耗時短。故選擇酸水解提取脂肪再皂化為最佳的非油脂樣品前處理方法。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

將角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度稀釋后，按照1.2氣相色譜條件進(jìn)行測定，考察方法線性。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度系列X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=2.072 2X+0.446 3，線性范圍為3.00～100 μ g/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，表明角鯊烯質(zhì)量濃度在3.00～100 μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限，其中角鯊烯的檢出限LOD和定量限LOQ分別1和3 μg/mL。當(dāng)稱樣量為1.0 g，定容體積為5.00 mL時，樣品檢出限LOD為0.5 mg/100 g，定量限LOQ為1.5 mg/100 g。詳見表2。

表1 非油脂樣品前處理方法對角鯊烯含量的影響

表2 方法的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及精密度RSD（N=6）

2.4 回收率和精密度

對橄欖油、羅漢果、帶魚三個不同的樣品進(jìn)行測定，按樣品中角鯊烯含量添加三個水平進(jìn)行回收率試驗，按照1.5節(jié)樣品前處理方法對樣品進(jìn)行處理，每個添加水平進(jìn)行6次重復(fù)測定。樣品測定值、加標(biāo)量、回收率詳見表3。角鯊烯的平均回收率在91.5%～99.7%之間，RSD為0.929%～3.26%，回收率滿足GB/T 27404—2008分析方法要求。

2.5 動植物樣品角鯊烯含量的測定

表4 五種動植物樣品的角鯊烯含量分析

采用上述方法對一批魚油、稻米油、牛油脂、核桃4種常見動植物樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，所測4種動植物樣品中均檢出角鯊烯，具體含量分別為魚油平均含量15.9 mg/100 mg、稻米油平均含量13.1 mg/100 mg、牛油脂平均含量9.81 mg/100 mg、核桃平均含量2.39 mg/100 mg。該方法簡單、穩(wěn)定、靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于動植物中角鯊烯含量的測定。

3 結(jié)論

試驗建立了氣相色譜測定動植物中角鯊烯含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，試驗方法測定動植物樣品加標(biāo)有較好的回收率，重現(xiàn)性好，靈敏度高，能夠滿足對樣品檢測的要求，同時該方法分離度高，方法可行，定量準(zhǔn)確。通過對幾種常見的動植物樣品進(jìn)行分析測定，確定了所測動植物中角鯊烯的含量，后續(xù)通過檢測更多種類的動植物樣品，能夠?qū)又参镏薪酋徬┖康姆植疾町愑懈尤娴恼J(rèn)識。

該方法實現(xiàn)了對動植物樣品中不同原料來源角鯊烯的檢測，這不僅為動植物中角鯊烯含量差異的研究提供了一種簡潔、高效的方法，也為其它類型樣品中不同原料來源角鯊烯的檢測提供了參考依據(jù)。