高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜測定白酒中甜蜜素

李首道，涂鳳琴，江小明，楊永，楊明，何麗姍*

武漢食品化妝品檢驗所（武漢 430012）

甜蜜素（環(huán)己基氨基磺酸鈉，Sodium cyclamate），是一種人工合成甜味劑，具有較高的甜味特性。GB 2760—2014中規(guī)定，白酒中不得添加甜蜜素，但依然有不法商家在白酒中違法添加甜蜜素來改善酒的甜度[1-3]。目前適用于白酒中甜蜜素的檢測標(biāo)準(zhǔn)是GB 5009.97—2016的第三法（液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）。但國標(biāo)中規(guī)定的正離子模式下監(jiān)測m/z 202＞122的分子離子峰存在響應(yīng)低、離子對干擾較大的問題。采用高分辨質(zhì)譜檢測，具有背景噪音低、檢測干擾小的優(yōu)勢，提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，試驗利用高分辨質(zhì)譜的精確分子量定性功能，且TOF具有與三重四極桿一樣的高靈敏度，對可能出現(xiàn)假陽性的樣品進(jìn)行確證，為確保食品安全監(jiān)管和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供技術(shù)支撐[4-10]。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX X500R四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（配有可用于電噴霧電離的Turbo V離子源，美國AB SCIEX公司）；LC 30A液相色譜儀（日本島津公司）；Allegra X-15R Centrifuge離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；PM5-2000 TL超聲波清洗器（普律瑪儀器公司）。白酒從市場上隨機(jī)抽取。

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液（環(huán)己基氨基磺酸鈉，純度＞98%，Dr.E公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）。去離子水（18.2 Ω·cm）由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

準(zhǔn)確稱取適量甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容，配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃保存；根據(jù)需要移取適量儲備液，用水稀釋，配制適當(dāng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 色譜條件

Waters XBridge C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μ m）；柱溫，40 ℃；進(jìn)樣量，5 μL；流速，0.5 mL/min。流動相A：5 mmol/L乙酸銨溶液。流動相B：乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～3 min，5%～90% B；3～5 min，90% B；5～5.1 min，90%～5% B；5.1～10.0 min，5% B。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：Turbo V ESI源。掃描模式：負(fù)離子掃描。檢測方式：高分辨多反應(yīng)監(jiān)測（MRM HR）采集模式。電噴霧電壓（IS）：-4 500 V。霧化氣壓力（GS1）：55 psi。輔助氣壓力（GS2）：60 psi。氣簾氣壓力（CUR）：35 psi。碰撞氣（CAD）：7 psi。離子源溫度（TEM）：450 ℃。

1.4 樣品處理

白酒樣品充分混勻，稱取10.0 g（精確到0.001 g）酒樣，置于100 mL燒杯中，于60 ℃水浴加熱30 min，殘渣全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，過0.22 μm濾膜后，供高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀測定，同時做空白試驗（除不加試樣外，其他步驟相同）。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜蜜素質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜較其它質(zhì)譜而言有以下優(yōu)勢：（1）高分辨率，其分辨率可達(dá)20 000 FWHM以上，可精確到小數(shù)點(diǎn)后4位，從而有利于對物質(zhì)進(jìn)行精確定性；（2）全掃描模式下的高通量分析。其原理是利用質(zhì)荷比與時間的關(guān)系進(jìn)行質(zhì)量分析，絕大多數(shù)離子源產(chǎn)生的離子均可到達(dá)檢測器，并顯示在一張圖譜上，質(zhì)量范圍寬。大大提高了離子傳輸效率，適合高通量檢測。而目前GB 5009.97—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》中規(guī)定，采用兩對離子進(jìn)行定性，監(jiān)測的離子對為m/z178＞79.9（ESI-）和m/z202＞122（ESI+），需要采用兩種采集模式進(jìn)行測定，且存在m/z202＞122（ESI+）響應(yīng)較低、干擾較大的問題。試驗利用高分辨質(zhì)譜的精確分子量定性功能，利用母離子精確定性功能，并結(jié)合178.056 9＞79.958 8離子對定量（相關(guān)參數(shù)列于表1），很好地解決了這個問題。

表1 甜蜜素的母離子、子離子等重要質(zhì)譜參數(shù)

2.2 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖及色譜圖

采用m/z178.056 9＞79.958 8為定量離子對，并進(jìn)一步優(yōu)化離子對的最佳碰撞能量。在SCIEX OS軟件中編輯母離子、子離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等MRMHR方法參數(shù)（表1）。MRM HR采集模式通過高質(zhì)量精度的特征碎片離子的峰面積進(jìn)行定量分析，并通過保留時間和離子相對豐度比進(jìn)行定性分析，測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。圖1為甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜掃描結(jié)果，圖2為甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。

圖1 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜掃描結(jié)果

圖2 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.3 具有與三重四極桿相同的峰面積精密度

高分辨質(zhì)譜具有與三重四極桿相比較有相同的峰面積精密度。重復(fù)測定同一樣品10次，結(jié)果見表2。RSD≤10%，證明采用高分辨質(zhì)譜法測定甜蜜素具有與三重四極桿相同的可靠性。

表2 重復(fù)測定10次甜蜜素的峰面積精密度

2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限與定量限

試驗以MRM HR掃描模式對樣品進(jìn)行定量分析。用初始流動相溶液配制一系列不同質(zhì)量濃度（0，10，20，30，50和100 ng/mL）的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以甜蜜素的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)（y），相應(yīng)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。結(jié)果表明，甜蜜素在0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=4 081.825x-0.066 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。在此次試驗測定條件下，甜蜜素的定量限（S/N≥10）為0.1 mg/kg。

圖3 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 回收率和精密度

選取空白白酒樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗，加標(biāo)水平為0.1，0.3和1.0 mg/kg，按此次試驗方法進(jìn)行預(yù)處理，每個添加水平進(jìn)行6次平行試驗，計算回收率和精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示），結(jié)果見表3。結(jié)果表明，甜蜜素的平均回收率為92.2%～98.9%，RSD為2.6%～5.8%。該方法回收率高、穩(wěn)定性好，適用于白酒中甜蜜素含量的測定。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用該方法對從市場上隨機(jī)抽取的50批次白酒中的甜蜜素進(jìn)行測定。結(jié)果表明，此次測定的樣品中甜蜜素檢出率為3.0%（最高含量達(dá)到0.52 mg/kg）。因此，白酒中甜蜜素的殘留問題應(yīng)引起相關(guān)部門的重視。

表3 白酒樣品中甜蜜素的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

試驗采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法對白酒中的甜蜜素進(jìn)行了準(zhǔn)確定量分析。樣品經(jīng)濃縮后用水定容，高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法進(jìn)行測定。以高分辨的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM HR）掃描模式進(jìn)行定量分析，極大提高了定量方法的準(zhǔn)確性。該方法快速、準(zhǔn)確、可靠，為甜蜜素的準(zhǔn)確測定提供了新思路。