分光光度法和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測奶粉中的左旋肉堿

王冬梅，楊明，邱肖依，胡筱靜，朱有濤，康翠欣

武漢食品化妝品檢驗所（武漢 430000）

左旋肉堿（L-carnitine），又稱左卡尼汀、肉毒素或維生素BT，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸，對人體無不良反應[1]。肉堿屬于類維生素，是人體自身合成的營養(yǎng)，是一種天然的物質(zhì)。左旋肉堿主要添加于嬰兒奶粉、老年人食品及運動員、高強度作業(yè)者食品和飲料中[2-3]。左旋肉堿作為營養(yǎng)強化劑用于嬰兒食品，在維持嬰兒生命及促進嬰幼兒發(fā)育的某些生理過程中發(fā)揮著重要的作用，如生酮作用、氮代謝[4]，所以左旋肉堿對嬰幼兒來說是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)。GB 10765—2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》規(guī)定，左旋肉堿為可選擇性加入成分，規(guī)定最小添加量為0.3 mg/100 kJ[5]。

試驗以嬰兒奶粉為研究基質(zhì)，分別采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和分光光度法進行檢驗，對兩種方法的回收率、精密度檢驗結(jié)果進行比較，同時說明兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著的差異。

1 材料、試劑和儀器

1.1 儀器與設備

SCIEX 4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有可用于電噴霧電離的Turbo V離子源），美國AB SCIEX公司；LC 30A液相色譜儀（日本島津公司）；電子分析天平（ME204/02），METTLERTOLEDO，Switzerland；UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津有限責任公司；實驗室pH計，F(xiàn)E20，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司。

1.2 試劑

鹽酸（分析純）、甲酸（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），試驗用水為二次蒸餾水；高氯酸（HClO4）、氫氧化鈉（NaOH）、氫氧化鉀（KOH）、2-硝基苯甲酸（C14H8N2O8S2）、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（C8H18N2O4S）、乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2·2H2O）、乙酰輔酶A（Acetyl CoA），在2～8 ℃保存；乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶（CAT）：在2～8 ℃保存。

2 樣品測定方法

2.1 紫外分光光度法分析步驟[6-7]

2.1.1 標準溶液配制

左旋肉堿標準儲備液（80 μg/mL）：準確稱取20 mg（精確0.000 1 g）于102±2 ℃烘箱中烘2 h的左旋肉堿，用水定容至250 mL容量瓶中。此液置于4 ℃冰箱中可保存1個月。

左旋肉堿標準工作液：分別吸取0.5，1，2，3和5 mL左旋肉堿標準儲備液于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。此溶液僅限于當天使用。

2.1.2 試樣處理

1) 準確稱取5 g（精確到0.000 1 g）混合均勻的固體樣品于燒杯中，用30 mL 40 ℃溫水溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中。加入10 mL 13% HClO4溶液，混合均勻后靜止20 min，用蒸餾水定容至刻度，混勻，用定量濾紙過濾。

2) 取20 mL濾液，用4 mol/L KOH溶液調(diào)pH至12.5～13.0后，于40 ℃水浴60 min。冷卻后用13% HClO4調(diào)pH至7.0～7.5。將樣液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容?；靹蚝笾糜? ℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫，取上清液，用0.45 μm濾膜過濾后備用。

2.1.3 標準曲線的繪制

吸取2.0 mL左旋肉堿標準工作液于1 cm比色皿中，加入0.8 mL顯色工作液和100 μL乙酰輔酶A溶液，蓋上比色皿蓋，混合均勻后放入分光光度計中，分光光度計的波長調(diào)為412 nm，5 min后歸零。迅速加入100 μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，混合均勻后放入分光光度計中，反應10 min后記錄吸光度。以左旋肉堿標準工作液的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，制作標準曲線。

2.2 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[7-8]

2.2.1 儀器分析條件

色譜柱XBridgeTMBEH HILIC（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）Column XP；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。流速：0.3 mL/min。柱溫：40 ℃。進樣量：2 μ L。洗脫梯度程序見表1。

表1 洗脫梯度程序

2.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子化源（AJS ESI源），正離子多反應監(jiān)測模式（MRM）檢測。離子噴射電壓5 000 V，溫度500 ℃，源內(nèi)氣體1（gs1，N2）壓力50 psi，源內(nèi)氣體2（gs2，N2）壓力50 psi，氣簾氣體（N2）壓力35 psi。采用切換法，左旋肉堿在4.22 min左右出峰，將2～6 rain的流出液導入離子源進行分析。左旋肉堿的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)如表2所示。

表2 左旋肉堿的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)

2.2.3 標準溶液配制

精密稱取左旋肉堿，用水溶解，配制成80 μg/mL的儲備液，再用蒸餾水稀釋，配制成1 μg/mL的中間液。中間液用蒸餾水稀釋成系列對照溶液供分析用。

2.2.4 樣品的前處理

稱取8 g均勻樣品于50 mL離心管中，加入40 mL水，渦旋混勻1 min，取2.5 mL上述混勻樣品，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入1.5 mL水，再加入16 mL乙腈-水（3︰1，V/V），提取液渦旋混勻1 min，再加入5 mL氫氧化鉀水溶液（1 mol/L）渦旋混勻1 min，于60℃水浴振蕩提取30 min，靜置在冷水浴中，冷卻至室溫，加入5 mL鹽酸水溶液（1 mol/L）渦旋混勻1 min，取1.8 mL混合液至離心管，以14 000 r/min離心5 min，取上清液，過微孔濾膜，用水稀釋100倍，供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

3 結(jié)果對比

3.1 紫外分光光度計法標準曲線

用紫外分光光度計法制定的標準曲線如圖1所示。在0～16 μg/mL范圍內(nèi)，用分光光度計測得的標準曲線線性關系很好。

圖1 紫外分光光度計標準曲線

3.2 液質(zhì)聯(lián)用標準曲線、檢出限

以0，2，10，50和200 ng/mL質(zhì)量濃度左旋肉堿標液為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性方程Y=7.92×104X+2.76×104，R2=0.998，說明在0～200 ng/mL范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好線性關系。結(jié)果見表3。

液質(zhì)聯(lián)用檢出限：取儲備液逐級稀釋，進樣量為2 μ L。以信噪比S/N=3計算左旋肉堿的檢出限（LOD），以信噪比S/N=10計算其定量下限（LOQ），并以標準品的質(zhì)量進行計算，得到左旋肉堿的LOD為0.109 μg/kg，LOQ為0.364 μg/kg，能夠滿足實際樣品分析對檢測限的要求。

3.3 兩種方法結(jié)果對比

3.3.1 兩種方法回收率結(jié)果

以市場購買的嬰幼兒乳粉作為基礎樣品，分別添加5，10，15和20 mg/100 g標準物質(zhì)，采用分光光度法和液質(zhì)聯(lián)用法進行測定，每個樣品檢測2次，對其回收率和精密度進行比較，兩種方法的加標回收率及相對標準偏差見表4。分光光度法的回收率為96.20%～101.40%，相對標準偏差為0.24%～1.95%。液質(zhì)聯(lián)用法的回收率為97.70%～103.80%，相對標準偏差為1.51%～2.94%。兩種方法的回收率均良好。

表3 液質(zhì)聯(lián)用標準曲線

表4 兩種方法的加標回收率及相對標準偏差比較

3.3.2T檢驗和F檢驗結(jié)果

分別用分光光度法以及液質(zhì)聯(lián)用法多次測定同一種樣品中的左旋肉堿的含量，結(jié)果見表5。

表5 分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法測定左旋肉堿的數(shù)據(jù)對比

分別用F檢驗和T檢驗分析分光光度法與液質(zhì)聯(lián)用法的檢測結(jié)果，其中F-檢驗雙樣本方差分析的結(jié)果見表6，T檢驗雙樣本等方差假設的結(jié)果見表7。

從F檢驗的結(jié)果來看，p＞0.05，說明兩種方法數(shù)據(jù)的方差無顯著差異，檢驗平均值時應采用等方差t檢驗。

表6 F-檢驗雙樣本方差分析

從T檢驗的結(jié)果來看，p＞0.05，說明兩種方法數(shù)據(jù)的平均值無顯著差異。從平均值結(jié)果也可以看出，液質(zhì)聯(lián)用法的平均值比分光光度法的平均值大0.10 mg/100 g，這可能是分光光度法的核心為酶反應和顯色反應，因此效率并非100%，所以分光光度法的結(jié)果略低于液質(zhì)聯(lián)用法。但兩種方法的檢測結(jié)果并無顯著差異。

表7 T-檢驗：雙樣本等方差假設

4 結(jié)論

通過分光光度法和液質(zhì)聯(lián)用法進行左旋肉堿的加標回收率的和精密度的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法的回收率均良好，均適用于嬰幼兒乳粉的檢測。另外對兩種方法的檢驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，通過F檢驗，發(fā)現(xiàn)兩種方法的方差無顯著差異；通過T檢驗發(fā)現(xiàn)，兩種方法的平均值也無顯著差異。兩種方法均可作為嬰幼兒乳粉中左旋肉堿含量的檢測方法，實際應用過程中，可根據(jù)樣品量，設備價格等多方面考慮選擇。