高效液相色譜法測(cè)定竹筷中15種防菌防腐劑

周銘林，何海彤，李聰*

廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（佛山 528300）

竹筷是以竹材、木材為原材料，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)牟馁|(zhì)預(yù)處理，進(jìn)行加工后用于食品接觸的竹木類(lèi)食品相關(guān)產(chǎn)品[1]。近年來(lái)，隨著外賣(mài)、快餐等餐飲行業(yè)迅速發(fā)展，竹筷成為必不可少的用餐工具，相應(yīng)衛(wèi)生監(jiān)控問(wèn)題不斷浮現(xiàn)[2-4]，而霉變腐爛問(wèn)題尤為突出[5-7]，一些生產(chǎn)企業(yè)采用價(jià)格低廉的化學(xué)防腐處理，如大量采用含硫漂煮劑、噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、聯(lián)苯、抑霉唑等化學(xué)防菌防腐劑，導(dǎo)致該類(lèi)添加劑在產(chǎn)品中殘留超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)增加，從而增加食品用竹木產(chǎn)品的安全隱患[8-9]。因此，建立高效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)竹筷中多種防菌防腐劑同時(shí)檢測(cè)，對(duì)該行業(yè)的食品安全控制具有重要意義[10]。

中國(guó)多數(shù)竹木筷產(chǎn)品檢測(cè)參照GB 19790.1—2005《一次性筷子第1部分：木筷》和GB 19790.2—2005《一次性筷子第2部分：竹筷》[11-12]，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定中只對(duì)噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、聯(lián)苯、抑霉唑有相應(yīng)檢測(cè)方法，而常使用的防菌防腐劑，如苯甲酸、尼泊金酯類(lèi)、納他霉素等，尚未建立多種防菌防腐劑同時(shí)快速檢測(cè)方法[13-17]，因此竹木食品相關(guān)產(chǎn)品不能得到有效監(jiān)控。試驗(yàn)運(yùn)用二極管檢測(cè)器在230 nm及254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，外標(biāo)法定量，建立高效液相色譜法同時(shí)分離檢測(cè)苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、富馬酸二甲酯、多菌靈、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、納他霉素、噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、五氯酚、抑霉唑、聯(lián)苯15種常用于食品及日化產(chǎn)品防菌防腐劑。解決檢測(cè)手段僅能檢測(cè)常規(guī)的幾種防菌防腐劑而無(wú)法對(duì)相關(guān)竹木食品相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行有效監(jiān)控的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、甲酸、乙酸銨（色譜純，德國(guó)CNW Technologies GmbH公司）；苯甲酸、山梨酸、五氯酚（中國(guó)計(jì)量科學(xué)院）；苯甲醇、多菌靈、抑霉唑、聯(lián)苯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、鄰苯基苯酚、噻苯咪唑（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；富馬酸二甲酯、納他霉素（TM standard）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30超高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司）；JP-0600超聲波清洗機(jī)（廣州吉普超聲波電子設(shè)備有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；JJ 500 Y電子天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱(chēng)取或移取一定量固體標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至容量瓶中，用甲醇定容配制成混合中間液，使用時(shí)根據(jù)濃度逐級(jí)稀釋成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品溶液的配置

將固體樣品切割并剪磨為粒徑小于5 mm×5 mm顆粒，準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g（準(zhǔn)確至0.001 g）試樣于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，擰緊蓋子，渦旋混勻后超聲提取20 min，在旋渦混勻器上混勻3 min，以3 000 r/min離心3 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至1 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱，Agilent（ZORBAX SB-C18）；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相，A為0.02 mol/L 乙酸銨溶液（含0.03%乙酸），B為甲醇；流速0.8 mL/min；梯度洗脫；流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度變化

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～400 nm對(duì)15種防菌防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，所有組分均在測(cè)試范圍內(nèi)具有吸收峰，其中苯甲酸、富馬酸二甲酯在230 nm附近，山梨酸、苯甲醇、尼泊金甲、乙、丙、丁酯、鄰苯基苯酚、聯(lián)苯在250 nm附近有較強(qiáng)吸收，多菌靈、噻苯咪唑、納他霉素、抑霉唑、聯(lián)苯在270～300 nm處。由于苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、富馬酸二甲酯、多菌靈的極性較強(qiáng)，出峰時(shí)間短，且多菌靈在230 nm下響應(yīng)較254 nm處更強(qiáng)，抑霉唑與聯(lián)苯出峰時(shí)間最長(zhǎng)，考慮抑霉唑在250 nm附近吸收弱，且出峰時(shí)間比聯(lián)苯早，確定7種組分的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，尼泊金甲、乙、丙、丁酯、鄰苯基苯酚、噻苯咪唑、納他霉素、五氯酚的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，采用雙波長(zhǎng)分段檢測(cè)即可兼顧各組分靈敏度。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相體系的確定

對(duì)比食品及化妝品中防腐劑檢測(cè)常用流動(dòng)相：甲醇-水、甲醇-乙酸銨、甲醇-乙酸銨（含0.03%乙酸）下各組分的分離效果及出峰時(shí)間。結(jié)果表明，流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，苯甲酸、山梨酸、尼泊金丙酯峰型不對(duì)稱(chēng)，抑霉唑與聯(lián)苯色譜峰出現(xiàn)部分重疊，影響分離效果；添加乙酸銨后，組分峰型得以改善，但苯甲酸、山梨酸出峰時(shí)間提前，苯甲酸與基底雜質(zhì)峰重疊；流動(dòng)相為甲醇-乙酸銨（含0.03%乙酸）時(shí)，苯甲酸色譜峰可與基底雜質(zhì)峰分離，且尼泊金丙酯色譜峰可與納他霉素色譜峰分離。因此，選用甲醇-乙酸銨（含0.03%乙酸）作為流動(dòng)相。

流動(dòng)相體系確認(rèn)后，對(duì)甲醇初始比例進(jìn)行優(yōu)化（5%，20%，30%和40%），甲醇比例5%時(shí)，試驗(yàn)需58 min，逐步提高初始甲醇濃度至40%，試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)可縮短至44 min，且各組分分離可保持良好。因此，以40%作為初始甲醇濃度。

2.2.2 色譜柱的選擇

高效液相色譜法檢測(cè)防菌防腐劑主要采用C18柱，試驗(yàn)比較Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m）及耐酸色譜柱Agilent Zorbax SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），150 mm色譜柱未能將所有組分完全分離，而組分在Extend-C18色譜柱及耐酸色譜柱中保留時(shí)間沒(méi)有顯著性差異，耐酸色譜柱較長(zhǎng)柱優(yōu)勢(shì)在于在同等試驗(yàn)條件下苯甲醇色譜峰吸收更強(qiáng)，且流動(dòng)相為酸性條件，酸柱在低pH條件下，具備良好穩(wěn)定性。

2.2.3 流速的選擇

分析不同流速（0.7，0.8和0.9 mL/min）對(duì)各組分分離效果的影響，試驗(yàn)表明，流速增快，各組分保留時(shí)間提前，但整體分離效果變化不大，考慮0.9 mL/min流速柱壓較0.8 mL/min高，試驗(yàn)選用流速0.8 mL/min，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下獲得的標(biāo)準(zhǔn)樣品圖見(jiàn)圖1，尼泊金丁酯陽(yáng)性樣品圖見(jiàn)圖2。

2.3 方法的線性范圍與檢出限

在最佳色譜條件下，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制線性回歸方程，得到各化合物的線性回歸方程。以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

選取空白試樣，采用試驗(yàn)前處理方法處理后，添加3個(gè)不同水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%），結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 15種標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖2 尼泊金丁酯檢出樣品

表2 線性范圍、回歸方程與檢出限

表3 樣品的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

2.5 實(shí)際樣品分析

采用該方法隨機(jī)選取市售的30批次竹木筷子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在30批次產(chǎn)品中，4個(gè)批次產(chǎn)品檢出尼泊金丙酯，濃度在3.2～5.4 mg/kg之間，2個(gè)批次產(chǎn)品檢出尼泊金乙酯，1個(gè)批次檢出濃度為5.2 mg/kg，抑霉唑，未發(fā)現(xiàn)超限量使用情況。

3 結(jié)論

建立一種同時(shí)測(cè)定竹筷中15種防菌防腐劑的高效液相色譜檢測(cè)方法，對(duì)色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，以0.02 mol/L乙酸銨（含0.03%乙酸）和甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到良好分離效果。該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度精密度均可滿足日常監(jiān)測(cè)需求。