花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取工藝

許靜，戴妙妙，魏蒙月，張赟彬, *，黃潤(rùn)宇，王思佳

1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院（上海 200234）；2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院（上海 201114）；3. 上海中僑職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院（上海 201319）；4. 上海中醫(yī)藥大學(xué)公共健康學(xué)院（上海 201210）

阿爾茲海默病（AD）是一種由多因素共同導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1-2]。在眾多假說(shuō)中以乙酰膽堿酶（AchE）水解神經(jīng)遞質(zhì)導(dǎo)致膽堿能活性下降的“膽堿能學(xué)說(shuō)”和AchE誘導(dǎo)大腦細(xì)胞外Aβ沉積的“β-淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)”得到廣泛支持[3-4]，這2種學(xué)說(shuō)都表明AchE在AD的形成中起到至關(guān)重要的作用。在《阿爾茨海默病2018年報(bào)告》指出AD在老年人群體的發(fā)病率僅次于心血管、腫瘤等老年性疾病，到2050年，全球AD患者預(yù)計(jì)約1.5億人[5]。AD不僅嚴(yán)重影響老年人健康，還給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[6]。因此，AchE抑制劑的開發(fā)具有重大意義。

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim），茴香科花椒屬，是中國(guó)的傳統(tǒng)調(diào)味香辛料，在中國(guó)主要分布于長(zhǎng)江流域及其南部地區(qū)[7]。近年來(lái)花椒的醫(yī)用價(jià)值受到廣泛關(guān)注，其中已被分離鑒定出富含有生物堿、香豆素、酰胺、黃酮和木質(zhì)素等活性成分[8-9]，藥理研究表明這些活性成分具有顯著的抗氧化[10]、抑菌[11]、抗癌[12]、抑制血小板凝集等[13]生物活性功效。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)四川花椒的95%乙醇提取物分離得到的異丁基羥酰胺可提高皮質(zhì)酮損傷PC12細(xì)胞存活率，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用。張鋒等[15]對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠用不同劑量的花椒多酚類化合物（ZPPC）總提取物進(jìn)行灌胃處理，發(fā)現(xiàn)ZPPC處理組小鼠腦組織SOD活力值上升，明顯改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外，有報(bào)道指出從花椒屬植物分離的吖啶類生物堿在體外表現(xiàn)出一定細(xì)胞毒活性和抗瘧活性[16-17]。關(guān)于花椒活性物質(zhì)提取及其功效研究已有不少報(bào)道，但從花椒中提取抗AchE活性物質(zhì)的研究仍鮮見相關(guān)報(bào)道。因此，以花椒為原料，以改良的Ellman比色法為測(cè)定方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取條件參數(shù)，為尋找新的AchE抑制劑來(lái)源和新型AD治療藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒粉（上海味好美食品有限公司）；AchE（5 00 U 2 mg）、碘代硫代乙酰膽堿（ATch）、二硫二硝基苯甲酸（DTNB）（美國(guó)Sigma公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、甲醇、乙酸乙酯（均為分析純，上海泰坦科技股份有限公司）。

ME204E電子天平（托利多儀器上海有限公司）；DK-S24恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋（常州翔天試驗(yàn)儀器廠）；EMS-20磁力攪拌油浴鍋（喬躍電子上海有限公司）；KQ-50DE超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BUCHI R-2真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi試驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易上海有限公司）；酶標(biāo)儀（島津中國(guó)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取10 g花椒粉于錐形瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)提取溶劑，于37 ℃水浴浸提60 min，回流提取，提取物過(guò)濾后旋蒸、冷凍干燥，干燥后樣品用PBS緩沖液稀釋至1.0 mg/mL，用于AchE抑制活性測(cè)定。

1.2.2 AchE抑制活性的測(cè)定[18]

試驗(yàn)在96孔酶標(biāo)板上進(jìn)行，設(shè)有空白組，空白對(duì)照組，測(cè)試組和測(cè)試對(duì)照組，每組做3個(gè)平行。試驗(yàn)組在96孔板中依次加入100 μ L PBS緩沖溶液、100 μ L樣品提取液、10 μL 2.0 U/mL AchE，混合均勻后在37 ℃培養(yǎng)20 min，取出后依次加入20 μL 0.6 mmol/L DTNB、20 μ L 0.6 mmol/L ATch，于37 ℃反應(yīng)20 min后在412 nm下測(cè)定吸光度。試驗(yàn)對(duì)照組用10 μ L的pH 8.0緩沖液代替10 μL的2.0 U/mL AchE溶液（扣除試驗(yàn)樣品本身顏色影響）。空白組用100 μL的PBS緩沖溶液代替100 μ L樣品提取液?？瞻讓?duì)照組用100 μ L磷酸緩沖液代替100 μ L樣品提取液、10 μ L緩沖液代替10 μ L的2.0 U/mL AchE溶液。

通過(guò)OD值評(píng)估對(duì)AchE的抑制活性，并根據(jù)式（1）計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)。

抑制率=[（空白組-空白對(duì)照組）-（試驗(yàn)組-試驗(yàn)對(duì)照組）]/（空白組-空白對(duì)照組）×100% （1）

1.2.3 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 提取溶劑種類的選擇

在料液比1︰12（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間120 min條件下，選擇乙酸乙酯、甲醇、乙醇和蒸餾水，按1.2.1方法提取并測(cè)定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

在料液比1︰12（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間120 min條件下，選擇50%，60%，70%，80%和90%不同乙醇體積分?jǐn)?shù)，按1.2.1方法提取并測(cè)定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.3 提取時(shí)間的選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1︰12（g/mL）、提取溫度70 ℃條件下，選擇提取時(shí)間60，90，120，150和180 min，按1.2.1方法提取并測(cè)定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.4 提取溫度的選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間90 min、料液比1︰12（g/mL）條件下，選擇提取溫度50，60，70，80和90 ℃，按1.2.1方法提取并測(cè)定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.5 料液比的選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間90 min、提取溫度條件80 ℃下，選擇料液比1︰9，1︰12，1︰15，1︰18和1︰21（g/mL），按1.2.1方法提取并測(cè)定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.4 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比為考察的4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3水平，以AchE抑制率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化花椒中抗AchE活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 溶劑種類對(duì)AchE抑制率的影響

由圖1可見，當(dāng)提取溶劑為乙醇時(shí)，AchE抑制率最高，為33.64%，甲醇提取液抑制率最低，為14.72%。乙醇是一種半極性溶劑，既能溶解生物堿類、苷類等極性溶劑所溶解的極性化合物，也能溶解揮發(fā)油、內(nèi)脂等非極性溶劑所溶解的非極性化合物，且在中藥材活性物質(zhì)提取中乙醇是較理想的提取溶劑[19-20]。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中提取溶劑選擇不同提交分?jǐn)?shù)乙醇溶液。

圖1 溶劑種類對(duì)AchE抑制率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AchE抑制率的影響

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～80%范圍內(nèi)，花椒提取液的AchE抑制率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，AchE抑制率達(dá)到最高值（41.60%）；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，AchE抑制率有所降低。這可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，抗AchE有效活性化合物浸出量增大，抑制率升高；而提取的抗AchE活性成分大多為極性物質(zhì)[21-22]，乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，使溶液極性降低，極性成分浸出量減少，導(dǎo)致AchE抑制率降低。因此，花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取溶劑選取80%乙醇溶液。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AchE抑制率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)AchE抑制率的影響由圖3可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，花椒提取液AchE抑制率呈先升后降趨勢(shì)。提取時(shí)間在60～120 min范圍內(nèi)，AchE抑制率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，AchE抑制率達(dá)到最大（54.88%），隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，AchE抑制率下降。這可能是隨時(shí)間延長(zhǎng)，花椒中抗AchE活性物質(zhì)得以充分浸出，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致浸出物質(zhì)分解失活，使有效活性成分損失。因此花椒中抗AchE活性物質(zhì)最佳提取時(shí)間選取120 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)AchE抑制率的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)AchE抑制率的影響

由圖4可見，提取溫度在50～80 ℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度升高，AchE抑制率逐漸增大，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，花椒提取液AchE抑制效果最佳，抑制率達(dá)到最大值（52.54%）；當(dāng)提取溫度大于80 ℃時(shí)，AchE抑制率下降。這可能是提取溫度升高使花椒細(xì)胞壁破損，溶劑擴(kuò)散滲透到細(xì)胞內(nèi)的速率加快，有效活性成分充分析出，80 ℃時(shí)有效成分完全浸出達(dá)到濃度平衡，繼續(xù)提高溫度，浸出有效成分分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)因高溫而受到破壞，導(dǎo)致AchE抑制率降低[23-24]。因此，花椒中抗AchE活性物質(zhì)最佳提取溫度選取80 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)AchE抑制率的影響

2.1.5 料液比對(duì)AchE抑制率的影響

由圖5可見，一定范圍內(nèi)料液比的增大有利于提高花椒提取液AchE抑制效果，花椒與80%乙醇溶液以1︰15（g/mL）料液比混合提取時(shí)，花椒提取液AchE抑制率最高，為58.22%。但隨溶劑體積增加，AchE抑制率稍有下降，可能是花椒中抗AchE活性物質(zhì)完全浸出，繼續(xù)增加溶劑使雜質(zhì)溶解量增加，影響花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取效果。因此，從節(jié)約成本和提取效率方面考慮，花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取最佳料液比選取1︰15（g/mL）。

圖5 料液比對(duì)AchE抑制率的影響

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以AchE抑制率為指標(biāo)，確定花椒抗AchE活性物質(zhì)提取的因素水平表，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

由表2中R值大小可知，影響花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取效果的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比，其中提取時(shí)間對(duì)花椒中抗AchE活性成分的提取效果影響最大，料液比對(duì)抗AchE活性成分的提取效果無(wú)明顯影響，因此花椒提取工藝的最佳組合為A2B2C1D3。由于化學(xué)穩(wěn)定性較差的浸出成分在過(guò)高的提取溫度下可能被降解失活，而且溫度越高，能源消耗和經(jīng)濟(jì)成本越大，綜合考慮成本和提取效率，最終確定最優(yōu)組合為A2B2C1D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1︰12（g/mL），提取溫度70 ℃、提取時(shí)間120 min。

表2 花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 工藝驗(yàn)證

采用正交最優(yōu)試驗(yàn)方案組合A2B2C1D1進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)定AchE抑制率為67.42%，高于正交試驗(yàn)測(cè)定出的試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明試驗(yàn)采用的工藝條件合理，優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

正交試驗(yàn)優(yōu)化確定花椒中抗AchE活性物質(zhì)提取的最佳工藝為：提取溶劑80%乙醇溶液，提取溫度70℃、提取時(shí)間120 min、料液比1︰12（g/mL）。以最佳工藝組合提取的花椒提取液抑制率為67.42%。

采用乙醇回流提取法，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化花椒中抗AchE活性物質(zhì)的提取工藝條件，建立從花椒中抗AchE活性物質(zhì)的有效制備方法，為花椒中活性成分對(duì)阿爾茨海默病的治療研究和阿爾茨海默病新型藥物研發(fā)提供參考依據(jù)，為相關(guān)腦損傷發(fā)展和相關(guān)認(rèn)知障礙提供研究方向。