酪蛋白-葡萄糖共聚物的制備

董建瓊，高昕悅，張春蘭, *

1. 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（阿拉爾 843300）；2. 南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室（阿拉爾 843300）

乳中含量較高的蛋白質(zhì)是酪蛋白，它是一種含有磷和鈣的結(jié)合蛋白質(zhì)。在牛奶中主要以磷酸二鈣、磷酸三鈣或兩者的復(fù)合物形式存在，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜[1]。目前利用蛋白質(zhì)作為天然的乳化劑和功能因子載體的研究報道較為常見。但是目前酪蛋白的一些功能特性還是存在一定的不足，極大地影響在一些領(lǐng)域的應(yīng)用，例如酪蛋白在較低的pH下，溶解性和乳化性都較差，限制了其使用范圍。因此，為了改善酪蛋白的功能特性，擴大其使用途徑、范圍，需要對酪蛋白進行改性研究。

蛋白質(zhì)和糖類作為食品中不可缺少的一部分，在食品體系中往往共存，在加熱條件下兩者會自發(fā)地進行美拉德反應(yīng)，不需要使用任何化學(xué)物質(zhì)作為催化劑。反應(yīng)后蛋白質(zhì)的水溶性、乳化性等都有較顯著的提高[2-3]，是目前蛋白質(zhì)改性眾多方法中較為理想的方法。蛋白質(zhì)接枝改性能提高蛋白質(zhì)的功能特性[4-7]，并具有安全性，在食品行業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。試驗以濕法接枝反應(yīng)制備酪蛋白-葡萄糖的接枝物，通過在不同的條件（pH、溫度、時間、底物濃度）對該接枝反應(yīng)進行分析，以期為酪蛋白-葡萄糖的實際制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、葡萄糖、β-巰基乙醇、鄰苯二甲醛等均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酪蛋白，阿拉丁試劑有限公司。

UM-4T磁力攪拌器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；LE 2002E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-2F精密pH計/酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UM-4T數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，金壇區(qū)科順儀器廠；GZX-9240 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；TGL-16C高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 酪蛋白-葡萄糖共聚物的制備

取1 g酪蛋白，加入5 mL的0.1 mol/L NaOH溶液使酪蛋白溶解，用pH 7的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液定容至100 mL，加入轉(zhuǎn)子，在磁力攪拌器上以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌3 h，放入冰箱靜置過夜，待用。

酪蛋白-葡萄糖共聚物制備方法：將一定量的酪蛋白溶液與一定量的葡萄糖溶于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，在磁力攪拌器上攪拌使其充分混勻，用1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至適宜的酸堿度。取2 mL處理好的溶液于離心管中，密封后在一定溫度下反應(yīng)一段時間后，立即用冰水浴冷卻至室溫，以7 000 r/min離心10 min，取上清液測定游離氨基含量。分別考察反應(yīng)時間（40，50，60，70和80 min）、反應(yīng)溫度（60，70，80，90和100 ℃）、pH（6，7，8，9和10）以及酪蛋白、葡萄糖這兩種底物的質(zhì)量配比（0.5︰10，1︰10，1.5︰10，2︰10和2.5︰10 g/g）對酪蛋白-葡萄糖共聚物接枝度的影響。

1.2.2 游離氨基的測定及接枝度的計算

采用OPA法進行游離氨基的測定[8]。OPA試劑的配制：稱取40 mg的鄰苯二甲醛于1 mL甲醇中攪拌溶解，加入2.5 mL 20%的SDS、25 mL 0.1 mol/L的硼砂和100 μL的β-巰基乙醇，用蒸餾水定容至50 mL。取4 mL的OPA試劑于試管中，加入200 μ L的樣品溶液，混合均勻后在35 ℃下水浴2 min，在340 nm下測定吸光度A1，以在OPA試劑中注入200 μL蒸餾水為空白樣。接枝度（DG）按式（1）計算。

式中：A0為未反應(yīng)時游離氨基的吸光度；A1為反應(yīng)一定時間后的游離氨基吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同反應(yīng)時間對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

在反應(yīng)初始pH為8、溫度為90 ℃條件的情況下，DG隨反應(yīng)時間變化的關(guān)系如圖1所示。隨著加熱時間的延長，酪蛋白-葡萄糖接枝度呈先升后降趨勢。酪蛋白的ε-氨基酸與葡萄糖分子的還原性醛基接觸后才會發(fā)生反應(yīng)，隨著加熱時間的延長，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸展開，將ε-氨基酸暴露在外，接枝度逐漸提高。在70 min時接枝度達到17.07%。當(dāng)加熱時間達到80 min時，接枝度稍有下降，這可能是過度加熱會使蛋白質(zhì)分子的一些賴氨酸結(jié)構(gòu)被破壞，并使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展而增加蛋白質(zhì)之間的相互作用而導(dǎo)致絮凝和沉淀，不利于接枝反應(yīng)進行。

圖1 不同反應(yīng)時間對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

2.2 不同反應(yīng)溫度對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

在反應(yīng)初始pH為8、反應(yīng)時間為70 min條件的情況下，DG隨反應(yīng)溫度變化的關(guān)系如圖2所示。隨著溫度的提高，接枝度在不斷提高，當(dāng)溫度為90 ℃時，DG達到12.73%；當(dāng)溫度大于90 ℃時，接枝度降低。這可能是反應(yīng)溫度過高使蛋白質(zhì)分子的賴氨酸部分破壞或蛋白質(zhì)的絮凝沉淀，阻礙了接枝反應(yīng)的進行。

圖2 不同溫度對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

2.3 不同pH對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

將酪蛋白與葡萄糖以質(zhì)量比1︰10（g/g）混合后，調(diào)節(jié)pH至6，7，8，9和10，在水浴溫度90 ℃下加熱70 min，測定接枝度。由圖3可知，當(dāng)pH小于8時，接枝度隨pH的增大而增大；當(dāng)pH為8時，接枝度達18.61%；而pH大于8時，接枝度隨pH增加而減小。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是在pH小于8時，美拉德反應(yīng)由于反應(yīng)環(huán)境偏酸而被抑制；在pH大于8時堿性逐漸增強，從而導(dǎo)致酪蛋白的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化如脫氨、脫羧和肽鍵斷裂，引起“胱賴反應(yīng)”，將氨基酸轉(zhuǎn)變成有毒的化合物[9-10]，因此不利于接枝反應(yīng)的進行。

圖3 不同pH對酪蛋白-葡萄糖接枝度的影響

2.4 不同酪蛋白-葡萄糖配比對接枝度的影響

在反應(yīng)初始pH為8、水浴溫度90 ℃下加熱70 min后，測定接枝度。如圖4所示，隨著酪蛋白-葡萄糖配比的增加，接枝度呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)?shù)孜锱浔葹?︰10（g/g）時，接枝度最大，為24.82%；當(dāng)?shù)孜锱浔却笥?︰10（g/g）時，接枝反應(yīng)受到抑制，說明適當(dāng)?shù)牡孜锱浔扔欣诶业鞍椎慕又Ψ磻?yīng)。若添加比例過高，羰基供體不足以與氨基供體結(jié)合，接枝反應(yīng)程度不足；若添加比例過低，葡萄糖會使溶液的空間位阻增大，分子之間的碰撞概率會減少而阻礙反應(yīng)的進行。

圖4 不同酪蛋白-葡萄糖配比對接枝度的影響

2.5 酪蛋白-葡萄糖濕法接枝反應(yīng)工藝優(yōu)化

從表1可以看出，影響酪蛋白-葡萄糖接枝反應(yīng)的因素依次為：pH＞底物配比＞時間＞溫度。酪蛋白-葡萄糖接枝反應(yīng)的最佳條件是A3B3C2D1，即反應(yīng)時間為80 min，反應(yīng)溫度為100 ℃，pH為8，底物配比為1︰10（g/g），此條件下接枝度為23.31%。

表1 酪蛋白-葡萄糖濕法接枝反應(yīng)正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

試驗研究了不同反應(yīng)時間、溫度、pH以及酪蛋白-葡萄糖配比對酪蛋白-葡萄糖共聚物接枝度的影響。結(jié)果表明：影響酪蛋白-葡萄糖濕法接枝反應(yīng)的因素依次為pH＞底物配比＞時間＞溫度，濕法接枝反應(yīng)時間為80 min，反應(yīng)溫度為100 ℃，pH為8，酪蛋白與葡萄糖比例為1︰10（g/g），此條件下接枝度可達23.31%。