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    銀耳多糖醇沉級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

    2020-04-03 13:59:10楊芳王藝涵袁辛銳遲原龍姚開賈冬英
    食品工業(yè) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:糖醇銀耳酪氨酸

    楊芳,王藝涵,袁辛銳,遲原龍,姚開,賈冬英*

    1. 四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院(成都 610065);2. 四川白家食品產(chǎn)業(yè)有限公司(成都 610065)

    酪氨酸酶是含銅的氧化還原酶,廣泛分布于生物體中,具有雙重催化活性,既可催化L-酪氨酸羥基化生成L-多巴,也可將L-多巴氧化生成多巴醌,后者進(jìn)一步氧化聚合形成黑色素[1],是參與人體皮膚黑色素形成的關(guān)鍵酶。抑制酪氨酸酶活性可減少體內(nèi)黑色素和色斑的生成,從而起到美白祛斑的作用[2-3]。從天然食材中提取分離得到安全、高效的酪氨酸酶抑制劑已成為目前研究熱點(diǎn)[4]。研究表明,某些植物多糖對(duì)酪氨酸酶活性具有一定抑制作用。Yang等[5]發(fā)現(xiàn),龍眼果皮多糖具有良好的酪氨酸酶抑制活性,能夠抑制L-酪氨酸生成L-多巴;Tang等[6]研究顯示,板栗多糖可抑制酪氨酸酶活性,該抑制作用屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

    銀耳俗稱白木耳、雪耳,自古以來就是女性美容養(yǎng)顏佳品。多糖是銀耳的主要活性物質(zhì),具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、修復(fù)記憶障礙等生物活性[7-9]。來吉祥等[10]發(fā)現(xiàn),銀耳多糖具有優(yōu)良的保濕功效,用于化妝品中可減輕皮膚粗糙度,增強(qiáng)皮膚彈性。劉卉[11]研究顯示,化妝品中以0.05%銀耳多糖替代0.02%透明質(zhì)酸能達(dá)到更好的保濕效果。然而,關(guān)于銀耳多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用卻鮮有報(bào)道?;诖耍囼?yàn)比較不同銀耳多糖醇沉級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用,探討其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類型,以期為銀耳多糖在化妝品中的高附加值利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    福建古田銀耳(市售)。

    酪氨酸酶(730 U/mg)、L-酪氨酸、L-多巴(上海源葉生物科技有限公司);1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品(2.5~5 348 kDa,色譜純?cè)噭绹?guó)Sigma公司)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SNB-2數(shù)字黏度計(jì)(上海精天儀器有限公司);UV6000PC-1100型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);Spectra Max 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);Waters Breeze GPC凝膠滲透色譜儀(美國(guó)沃特斯有限公司)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 銀耳多糖分步醇沉級(jí)分的制備與純化

    1.3.1.1 銀耳多糖分步醇沉級(jí)分的制備

    參考高溫高壓法[12]提取銀耳多糖,并稍作修改。稱取一定質(zhì)量的干銀耳,加入其60倍質(zhì)量的飲用純凈水,浸泡20 min后打漿,將所得漿液于0.1 MPa、121℃下加壓提取30 min,離心后得到上清液,于60 ℃下真空濃縮使其黏度達(dá)到3.4±0.1 Pa/s(25 ℃,轉(zhuǎn)子#4,60 r/min),得到濃縮液。

    在濃縮液中加入無水乙醇使體系乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)20%,攪拌后于4 ℃下靜置24 h,離心后分別收集沉淀物與上清液;將所得沉淀物用無水乙醇及丙酮洗滌、抽濾后進(jìn)行真空冷凍干燥,得到銀耳多糖醇沉級(jí)分STP 20。將所得的上清液真空濃縮至上述黏度,加入無水乙醇調(diào)整體系乙醇體積分?jǐn)?shù)40%,攪拌后按照上述方法進(jìn)行靜置沉淀和離心、洗滌、抽濾、干燥得到STP 40。將所得上清液按照上述方法依次調(diào)整體系的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到60%,80%得到銀耳多糖級(jí)分STP 60、STP 80。將得到的4種銀耳多糖級(jí)分稱質(zhì)量后按照式(1)計(jì)算其得率。

    式中:m為干燥多糖級(jí)分質(zhì)量,g;M為干銀耳質(zhì)量,g。

    1.3.1.2 銀耳多糖醇沉級(jí)分STP 60的純化

    采用DEAE-Cellulose 52柱層析,濕法裝柱(Φ2×30 cm)。配制10 mg/mL的STP 60水溶液,以0.4 mL/min流速上樣10 mL后先用多于1倍柱體積的去離子水洗脫,依次用0.2,0.4和0.6 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫,每10 min收集1管;隔管取0.5 mL,用苯酚-硫酸法檢測(cè)其多糖含量,繪制洗脫曲線;收集同一洗脫峰溶液,經(jīng)透析、濃縮、凍干后得到純化STP 60。

    1.3.2 銀耳多糖醇沉級(jí)分純度測(cè)定

    以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品,苯酚-硫酸法[13]測(cè)定其在不同質(zhì)量濃度下反應(yīng)液的吸光度,以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸后得到回歸方程y=0.008 1x-0.010 6(R2=0.999 1)。按照同樣方法測(cè)定4種銀耳多糖醇沉級(jí)分溶液的吸光度,將其代入回歸方程后計(jì)算出多糖樣品的純度。

    1.3.3 銀耳多糖醇沉級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量與純化STP 60的單糖組成分析

    1.3.3.1 醇沉級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

    參照Mao等[14]所述凝膠滲透色譜法測(cè)定銀耳多糖級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量。GPC色譜條件:色譜柱為Ultrahyrogel linear(7.8 mm×300 mm),檢測(cè)器為2400示差折光檢測(cè)器,柱溫40 ℃,流動(dòng)相為0.2 mol/L NaNO3溶液,pH 6.0,流速0.6 mL/min,對(duì)照品為窄分布的葡聚糖。

    1.3.3.2 純化STP 60的單糖組成分析

    參考Dai等[15]所述的3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生HPLC法,測(cè)定純化STP 60的單糖組成。以鼠李糖、巖藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸為對(duì)照品。

    HPLC條件:色譜柱為SHISEIDO C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、柱溫25 ℃、流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)和乙腈混合液(82︰18,V/V)、流速1.0 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

    1.3.4 銀耳多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

    1.3.4.1 對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制作用

    參考Maisuthisakul等[16]方法,并稍作修改。將90 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 6.8)和50 μL 100 μg/mL酪氨酸酶溶液依次加入到50 μL 1 mg/mL銀耳多糖醇沉級(jí)分溶液中,混合均勻后于37 ℃下預(yù)熱5 min,加入60 μL 2.5 mmol/L的L-酪氨酸溶液,混勻后于該溫度下保持10 min,振蕩后立即于490 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,每一樣品重復(fù)測(cè)定3次。按照以式(2)計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制作用。

    式中:A1、A2、A3、A4分別是樣品組、樣品背景組(PBS代替酪氨酸酶)、空白組(蒸餾水代替樣品)、空白背景組(蒸餾水代替樣品、PBS代替酪氨酸酶)的吸光度。

    1.3.4.2 對(duì)酪氨酸酶雙酚酶的抑制作用

    參照上述單酚酶抑制作用步驟,以2.5 mmol/L L-多巴溶液替代2.5 mmol/L L-酪氨酸溶液,于37 ℃下繼續(xù)保持2 min,振蕩后立即于490 nm處測(cè)定吸光度。按照式(2)計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶雙酚酶抑制率。

    1.3.5 銀耳多糖STP 60對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制作用類型與動(dòng)力學(xué)分析

    1.3.5.1 抑制作用類型分析

    固定底物L(fēng)-酪氨酸溶液濃度2.5 mmol/L,改變酪氨酸酶濃度,測(cè)定4種質(zhì)量濃度STP 60時(shí)的酶活力,以酪氨酸酶濃度為橫坐標(biāo)、酪氨酸酶活力為縱坐標(biāo)作圖,根據(jù)二者的關(guān)系判斷STP 60對(duì)該酶的抑制作用[17]。

    1.3.5.2 抑制作用動(dòng)力學(xué)分析

    固定酪氨酸酶質(zhì)量濃度為100 μ g/mL,改變底物L(fēng)-酪氨酸濃度,測(cè)定4種質(zhì)量濃度STP 60時(shí)的酶活力,根據(jù)Lineweaver-Burk法繪制底物濃度與酶反應(yīng)速率的雙倒數(shù)圖,分析STP 60對(duì)酪氨酸單酚酶的動(dòng)力學(xué)[18]。

    1.3.6 數(shù)據(jù)分析

    除分子量外,其余試驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用OriginPro 2017繪圖,采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 銀耳多糖醇沉級(jí)分的得率和純度及相對(duì)分子質(zhì)量與單糖組成

    4種銀耳多糖醇沉級(jí)分的得率、純度及分子量見表1。4種銀耳多糖級(jí)分的得率和純度差異顯著,以STP 60為最高,表明銀耳多糖主要是由STP 60為代表的中分子量多糖構(gòu)成。隨著醇沉?xí)r乙醇體積濃度增大,銀耳多糖級(jí)分的重均分子量和數(shù)均分子量逐漸減小,但均在同一數(shù)量級(jí);4種級(jí)分的多分散系數(shù)遠(yuǎn)大于1,表明其分子量分布范圍較廣,以STP 60最為明顯。

    表1 銀耳多糖分步醇沉級(jí)分的得率和純度與相對(duì)分子質(zhì)量

    純化STP 60經(jīng)PMP柱前衍生后的HPLC檢測(cè)圖譜如圖1所示。STP 60是由甘露糖、巖藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖和半乳糖醛酸組成,其摩爾比為871.72︰323.94︰251︰218.03︰15.51︰3.95︰2.01︰1.66︰1.03︰0.74。銀耳多糖的單糖組成以甘露糖、巖藻糖、木糖和葡萄糖醛酸為主,甘露糖含量最高,因此STP 60可能是以甘露聚糖為主鏈的酸性雜多糖。試驗(yàn)結(jié)果與Ukai等[19]得到的銀耳子實(shí)體多糖的單糖組成相似,但其含量差異較大,尤其是巖藻糖的含量明顯偏高,這可能與銀耳的產(chǎn)地、栽培方式及多糖的提取方法有關(guān)。

    圖1 純化STP 60的HPLC色譜圖

    2.2 銀耳多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

    4種銀耳多糖級(jí)分對(duì)酪氨酸酶單酚酶和雙酚酶的抑制作用如圖2所示。它們對(duì)酪氨酸酶均有一定抑制作用,其對(duì)單酚酶活性的抑制作用明顯強(qiáng)于雙酚酶,其中STP 60的抑制作用最大,STP 20的抑制作用最小。4種級(jí)分的抑制作用與其純度呈正相關(guān),純度越高,其抑制作用越大。純度最高的STP 60在質(zhì)量濃度為1 mg/mL的條件下,對(duì)單酚酶和雙酚酶的抑制率分別為37.55%和9.94%,其抑制作用明顯高于羊棲菜多糖[20]和板栗多糖[6]。然而,銀耳多糖級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用明顯低于維生素C,這主要是因?yàn)楹笳呒仁且环N強(qiáng)抗氧化劑,也是一種金屬離子螯合劑,它可以通過強(qiáng)大的抗氧化和螯合銅離子2種途徑產(chǎn)生明顯的抑酶作用。

    圖2 銀耳多糖級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

    2.3 STP 60對(duì)酪氨酸單酚酶的抑制作用類型與抑制動(dòng)力學(xué)

    抑制劑對(duì)酶活性的抑制作用分為可逆抑制和不可逆抑制。利用酶活性與酶的關(guān)系圖區(qū)分可逆抑制劑和不可逆抑制,直線過原點(diǎn)為可逆抑制,直線平行則為不可逆抑制。在酶活測(cè)定體系中,加入不同質(zhì)量濃度的STP 60,以酪氨酸酶濃度為橫坐標(biāo)、酶活力為縱坐標(biāo)作圖,得到二者之間的關(guān)系,如圖3所示??梢钥闯觯?條直線均通過原點(diǎn),且隨著STP 60濃度增大,直線斜率變小,說明STP 60對(duì)酪氨酸酶的抑制作用具有可逆性,與酶之間以非共價(jià)鍵發(fā)生可逆結(jié)合[16],不會(huì)使酪氨酸酶永久失活。

    圖3 酪氨酸酶單酚酶活性與酶濃度的關(guān)系

    圖4 為4種質(zhì)量濃度的STP 60對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。4條直線均相交于第二象限X軸上一點(diǎn),隨著STP 60濃度增大,直線與縱坐標(biāo)截距增大,也就是說,隨著STP 60濃度增加,米氏常數(shù)Km保持不變,最大反應(yīng)初速度Vmax逐漸減小。參數(shù)變化表明,STP 60對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,即底物、抑制劑和酶之間的結(jié)合無競(jìng)爭(zhēng)性。因此,STP 60對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制,這一結(jié)果與Yang等[5]關(guān)于龍眼皮多糖的研究結(jié)果一致。對(duì)酪氨酸酶而言,其非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常是由于結(jié)合酶活性中心以外的殘基而影響了酶活性,也可能是由于抑制劑對(duì)氧自由基的清除作用阻礙酶催化反應(yīng)[4]。

    圖4 STP 60對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖

    3 結(jié)論

    4種銀耳多糖醇沉級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的單酚酶活性和雙酚酶活性均具有一定抑制作用,且對(duì)單酚酶活性的抑制作用明顯強(qiáng)于雙酚酶活性抑制,其中STP 60對(duì)單酚酶活性的抑制作用最大,屬于非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制。有關(guān)銀耳多糖對(duì)此酶的抑制作用機(jī)理有待深入探討。

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