非小細(xì)胞肺癌患者外周血及腫瘤組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)及其對巨噬細(xì)胞活性的影響

魏徵霄，何雪梅

(1.四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，四川瀘州 646000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌中發(fā)病率最高的腫瘤疾病，其發(fā)病人數(shù)占據(jù)肺癌總數(shù)的80%，也是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因[1-2]。大多數(shù)NSCLC患者確診時(shí)已為中晚期，由于免疫系統(tǒng)失調(diào)，癌細(xì)胞快速增殖并轉(zhuǎn)移到其他部位，導(dǎo)致預(yù)后極差，5年生存率約為20%[3]。有研究指出，免疫系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用，尤其是T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3(Tim-3)是T細(xì)胞表面重要的信號(hào)分子，具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，與相應(yīng)的配體結(jié)合可激活相關(guān)信號(hào)通路從而抑制Th1細(xì)胞功能[4-5]。程序性死亡蛋白配體-1(PD-1)作為負(fù)性調(diào)控分子，與T細(xì)胞耗竭密切相關(guān)[6-7]。有報(bào)道顯示，腫瘤疾病中巨噬細(xì)胞活化可影響相關(guān)生長因子而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、浸潤，加劇病情進(jìn)展[7-9]。但在NSCLC中，外周血、肺癌組織、正常組織Tim-3 和PD-1的表達(dá)對巨噬細(xì)胞活化有何影響未見報(bào)道。本研究旨在探討NSCLC患者外周血、腫瘤組織及正常組織中CD4+T細(xì)胞上Tim-3和PD-1的表達(dá)及其對巨噬細(xì)胞活性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2018年6月收治住院的首次診斷為NSCLC的64例患者作為研究對象。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次診斷為NSCLC，且病理HE染色確診者；(2)屬原發(fā)性腫瘤者；(3)行手術(shù)切除術(shù)后未進(jìn)行放療及化療者；(4)臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)肝腎功能異常、合并心腦血管疾病者；(3)精神異常不配合者。入選患者中男35例，女29例；年齡51～74歲，平均(64.73±9.28)歲；肺鱗狀細(xì)胞癌42例，腺癌22例；根據(jù)2009年UICC第7版TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期27例，Ⅲ期37例。同時(shí)，選取40例健康者作為健康對照組，其中男22例，女19例；年齡48～72歲，平均年齡(62.18±8.75)歲，本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意后開展。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 治療前，清晨采集NSCLC患者空腹靜脈血(4 mL),3 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃凍存?zhèn)溆?。同時(shí)，抽取健康對照組人群靜脈血作為對照?；颊吆炇鹬橥鈺螅占中g(shù)切除的肺癌組織標(biāo)本，以及癌旁5 cm以上的正常肺組織(HE染色證實(shí)無腫瘤浸潤)。樣品制備：取部分腫瘤組織和對應(yīng)的正常組織置于含有慶大霉素(900 IU/mL)、青霉素(500 IU/mL)及鏈霉素(500 μg/mL)的無血清培養(yǎng)基中，并將組織剪切成 1～2 mm3的組織碎塊；采用消化酶液體(膠原酶Ⅰ1 μg/mL，膠原酶Ⅳ1 μg/mL，DNase 25 μg/mL，2%胎牛血清混合配置)消化30 min，經(jīng)Percoll組織標(biāo)本分離液獲取單細(xì)胞懸液備用。

1.2.2流式法檢測外周血及肺組織Tim-3和PD-1表達(dá) 流式法檢測在 CD4+T 細(xì)胞上Tim-3和 PD-1的表達(dá)：取外周抗凝血，腫瘤組織及正常組織單細(xì)胞懸液各 100 μL，然后加入5 μL熒光標(biāo)記的特異性抗體，包括抗Tim-3-PE、抗 PD-1-FITC及抗 CD4-PerCP-cy5.5，排除死細(xì)胞后混勻置于冰上避光孵育20 min；同時(shí)，設(shè)定各對照管。反應(yīng)完畢后，將1 mL紅細(xì)胞裂解液加至外周血流式管中，振蕩混勻，避光放置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng) 20 min，腫瘤組織及癌旁組織單細(xì)胞懸液管可略過此步驟。將含有5%牛血清清蛋白及0.09%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液(FACS緩沖液，2 mL)離心后，去除上清液，再用 300 μL 的 FACS 緩沖液重懸。最后，采用FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，通過FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg1) mRNA水平 各組肺組織40 mg，根據(jù)試劑盒說明書，采用TRizol法提取總RNA，測定水平；然后根據(jù)cDNA Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。GAPDH、iNOS和Arg1 mRNA水平按照操作說明，在Takara qPCR儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系中總體積10 μL：cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s；循環(huán)40次。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并以GAPDH作為內(nèi)參測定iNOS和Arg1 mRNA水平；定量PCR特異產(chǎn)物通過熔解曲線分析，以2-ΔΔCt表示相對基因表達(dá)變化。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1外周血中Tim-3和PD-1的陽性表達(dá)比較 見圖1，肺癌患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3表達(dá)百分比為4.96%(0.94%～28.46%)，PD-1表達(dá)百分比為24.13%(12.05%～33.64%)，均顯著高于健康對照組的Tim-3和PD-1表達(dá)水平[2.05%(0.54%～7.04%)及10.25%(3.12%～20.68%)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021，P=0.005)。且肺癌患者外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+的表達(dá)水平為4.36%(2.73%～27.94%)，明顯高于其在健康對照組外周血中的表達(dá)[2.63%(1.27%～25.08%)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。

2.2肺組織中Tim-3和PD-1的陽性表達(dá)比較 見圖2，肺癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(28.52%vs. 11.59%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)；同時(shí)肺癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平也顯著高于正常組織(41.73%vs. 20.26%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。進(jìn)一步分析肺組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1的共表達(dá)情況，肺癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+共表達(dá)明顯高于正常組織(36.72%vs. 16.28%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。

圖1 外周血CD4 陽性細(xì)胞上Tim-3和 PD-1表達(dá)水平比較

2.3肺組織中巨噬細(xì)胞活性物質(zhì)iNOS和Arg1 mRNA水平比較 與癌旁正常組織比較，肺癌組織中iNOS mRNA略有降低(P>0.05)，而Arg1 mRNA水平則顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.953,P=0.012)。見表2。

表2 肺組織中巨噬細(xì)胞活性物質(zhì)iNOS和Arg1 mRNA水平比較

2.4肺組織中Tim-3和PD-1表達(dá)與巨噬細(xì)胞活性的相關(guān)性 采用Pearson相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，肺組織中Tim-3、PD-1表達(dá)和Tim-3+PD-1+共表達(dá)與巨噬細(xì)胞活性iNOS/Arg1比值均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),見表3。

表3 肺組織中Tim-3和 PD-1表達(dá)與巨噬細(xì)胞活性的相關(guān)性

圖2肺組織CD4陽性細(xì)胞上Tim-3和PD-1表達(dá)水平比較

3 討 論

腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤及擴(kuò)散過程中，巨噬細(xì)胞及其炎癥因子對促進(jìn)腫瘤血管生長起著重要作用，巨噬細(xì)胞活化可加速機(jī)體代謝，通過免疫系統(tǒng)介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路促使腫瘤細(xì)胞增殖、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致疾病惡化[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3和 PD-1等負(fù)性調(diào)控因子，在惡性腫瘤中CD4+T淋巴細(xì)胞上大量表達(dá)，與相應(yīng)的配體結(jié)合可激活相關(guān)信號(hào)通路從而抑制Th1細(xì)胞功能，其增高導(dǎo)致負(fù)性免疫調(diào)節(jié)，加快了腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖及轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)，正常細(xì)胞更易發(fā)生凋亡，預(yù)后極差[12]。

本研究得到了類似的結(jié)果，肺癌患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3、PD-1表達(dá)百分比為4.96%和24.13%，均顯著高于健康對照組的2.05%及10.25%(P<0.05)；且肺癌患者外周血 CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+的表達(dá)水平為4.36%，也明顯高于健康對照組的2.63%，這一結(jié)果提示，NSCLC患者肺癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1高表達(dá)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)肺癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，同時(shí)肺癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平也顯著高于正常組織。為進(jìn)一步分析肺組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和 PD-1的共表達(dá)情況，檢測得到肺癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+共表達(dá)明顯高于正常組織。這證實(shí)Tim-3通過提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增，再介導(dǎo)PD-1信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，形成負(fù)性的腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。

前期研究證實(shí)，腫瘤疾病中巨噬細(xì)胞活化，例如促使M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細(xì)胞可分泌相關(guān)生長因子而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、浸潤，加劇病情進(jìn)展[6-7]。本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常組織比較，肺癌組織中M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS mRNA略有降低(P>0.05)，而M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg1 mRNA水平則顯著升高，說明巨噬細(xì)胞活性發(fā)生變化。為探討肺癌組織中Tim-3和 PD-1表達(dá)與巨噬細(xì)胞活性的相關(guān)性，本研究采用了Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)肺組織中Tim-3、PD-1表達(dá)和Tim-3+PD-1+共表達(dá)與巨噬細(xì)胞活性iNOS/Arg1 比值均呈負(fù)相關(guān)，Tim-3、PD-1表達(dá)越高，Arg1 mRNA水平越高，iNOS/Arg1 比值越低，這和張娟等[6]的報(bào)道一致。

4 結(jié) 論

NSCLC患者外周血及腫瘤組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1表達(dá)上調(diào)，促使M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用。