肛門區(qū)鱗狀細胞癌和鱗狀上皮內(nèi)瘤變組織中HPV感染型別的研究*

季月霞,武曉雷,耿建祥△,仲玉英,吳 沖,吳昆嵐,張金浩,梅 靜,趙 雪

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院病理科,江蘇常熟 215500；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院病理科,江蘇南京 210022)

肛門區(qū)鱗狀細胞癌的發(fā)病率在一般人群中為1/10萬,是一種比較少見的惡性腫瘤,過去20～30年,美國男性和女性肛門區(qū)鱗狀細胞癌的發(fā)病率分別增加96%和39%。男性同性戀者(MSM)肛門區(qū)鱗狀細胞癌的發(fā)病率據(jù)估計為35/10萬。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的MSM發(fā)生肛門區(qū)鱗狀細胞癌的風(fēng)險可能是非HIV感染MSM的2倍。有肛門性交的男性人群發(fā)病率比一般人群高,性行為的方式是導(dǎo)致肛門區(qū)鱗狀細胞癌發(fā)病率上升的重要因素之一。有研究發(fā)現(xiàn),90%左右的肛門區(qū)鱗狀細胞癌與高危型人乳頭瘤病毒(HRHPV)感染密切相關(guān),宮頸部位和肛門部位在人乳頭瘤病毒(HPV)感染的型別上高度一致,這意味著肛門部位與宮頸部位具有共同的感染來源[1-4]。國內(nèi)文獻中少見關(guān)于肛門區(qū)鱗狀細胞癌及肛門區(qū)上皮內(nèi)瘤變(AIN)組織感染HPV的研究報道。為了進一步了解我國肛門區(qū)鱗狀細胞癌及AIN組織中的HPV感染及型別分布情況，筆者對28例肛門區(qū)鱗狀細胞癌及20例低級別和34例高級別AIN患者的發(fā)病年齡及HPV感染型別的分布進行了分析,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院全國肛腸醫(yī)療中心治療的5例外痔及5例混合痔患者，女5例，男5例；患者年齡25～68歲，平均50.12歲，收集上述人群肛門周圍正常的鱗狀上皮石蠟組織標(biāo)本。選取1995年1月至2018年12月于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院以及南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院就診的肛門區(qū)鱗狀細胞癌及AIN患者，其中肛門區(qū)鱗狀細胞癌28例，女13例、男15例,病變發(fā)生于肛管的15例、肛緣的13例,患者年齡40～86歲、平均61.96歲；低級別AIN 20例，女6例、男14例,發(fā)生于肛管的7例、肛緣的13例,患者年齡24～68歲、平均43.85歲；高級別AIN患者34例,女19例、男15例,發(fā)生于肛管的9例、肛緣的25例,患者年齡23～86歲、平均48.27歲。收集上述人群的石蠟組織標(biāo)本，由2位年資較高的主治醫(yī)師級別以上的病理科醫(yī)師按照WHO(2014年)組織學(xué)消化道腫瘤的分類標(biāo)準(zhǔn)進行組織切片病理結(jié)果復(fù)核。

1.2儀器與試劑 基因擴增儀為Gene Amp PCR system 2400型；分子雜交儀為江蘇省興化市分析儀器廠生產(chǎn)的FYY-3型；高速冷凍離心機為Eppendorf公司生產(chǎn)的5810 R型；生物安全柜為江蘇省蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BHC-1300ⅡA2型；青島海爾有限公司生產(chǎn)的-20 ℃冰箱等。HPV基因分型檢測試劑盒由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供。顯色液須新鮮配制，使用時所需水平通過加蒸餾水配制。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的采集 先去除每例石蠟組織周邊多余的石蠟,將石蠟組織切成4 μm厚的切片,切3～5片石蠟組織即可。用專用的鑷子輕輕夾取,放入小離心管中,切第2例石蠟組織前,用次氯酸鈉溶液擦刀片及鑷子各3次。

1.3.2DNA的提取 將切下的石蠟組織片放入1.5 mL離心管中,加入裂解液150 μL,充分振蕩混勻,兩者均在金屬浴中加熱100 ℃ 10 min,立即13 000 r/min離心10 min后,取中間層DNA溶液待用。PCR擴增、雜交、孵育和顯色按說明書進行規(guī)范操作。每份標(biāo)本顯色后根據(jù)雜交信號的有無來判斷結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 正常的肛門區(qū)周圍的鱗狀上皮組織、肛門區(qū)鱗狀細胞癌及AIN組織HPV檢出率及各HPV型別的比例采用HPV分型統(tǒng)計軟件(南京倍寧醫(yī)療器械有限公司提供)進行分析,對分析出來的相關(guān)數(shù)據(jù),應(yīng)用統(tǒng)計軟件包SPSS13.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,計數(shù)資料以百分率表示，百分率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

10例肛門周圍正常的鱗狀上皮組織中HPV陽性者1例,總檢出率為10.00%(1/10),其中1例為單型感染者(HPV11型)。20例低級別AIN,34例高級別AIN及28例肛門區(qū)鱗狀細胞癌組織中HPV陰性者、陽性者、總檢出率,單型、多型、低危型、高低危型、高危型感染者例數(shù)及百分比見表1。肛門區(qū)鱗狀細胞癌中總的HPV檢出率為82.14%(23/28),其中HRHPV檢出占100.00%(23/23)；20例低級別AIN總的HPV檢出率為55.00%(11/20),其中HRHPV占45.46%(5/11)；34例高級別AIN總的HPV檢出率為79.41%(27/34),其中HRHPV占85.19%(23/27)。HPV各型別感染分布情況見表2。

表1 3種肛門病變組織的HPV感染情況[n(%)]

肛門區(qū)正常的鱗狀上皮組織中HPV總檢出率與低級別及高級別AIN組織和肛門區(qū)鱗狀細胞癌組織中HPV總檢出率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低級別與高級別AIN組織中HPV總檢出率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；低級別AIN與肛門區(qū)鱗狀細胞癌組織的HPV總檢出率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高級別AIN組織和肛門區(qū)鱗狀細胞癌組織的HPV總檢出率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 3種肛門病變組織的HPV感染型別分布(n)

注:對于多重感染者,各型別的陽性重復(fù)計算;/表示無該型別的感染。

3 討 論

肛門區(qū)鱗狀細胞癌是發(fā)生于中年人的一種少見但發(fā)病率正在不斷上升的上皮性惡性腫瘤。每年肛門區(qū)癌發(fā)病率在異性戀人群中約為1/10萬,在行肛門性交的男性群體中其發(fā)病率明顯增高。根據(jù)肛門區(qū)癌發(fā)生的部位可分為肛管癌與肛緣癌兩類,大約占下消化道惡性腫瘤的4%。肛門區(qū)癌最常見的組織學(xué)類型是鱗狀細胞癌,其他少見的組織學(xué)類型包括腺癌、移行細胞癌、基底細胞樣癌或黏液表皮樣癌[1]。本文報道的82例患者是常見的肛門區(qū)病變,即28例鱗狀細胞癌及54例AIN。HPV有許多不同的型別。目前，根據(jù)HPV致病性的差異性將HPV分為兩大類。一類為低危型HPV:主要引起肛門區(qū)及外生殖器皮膚的疣類病變或?qū)m頸和肛門區(qū)低級別AIN,其型別主要有6、11、30、42、43、44型等。另一類為HRHPV:可誘發(fā)生殖器癌、宮頸癌、肛門區(qū)鱗狀細胞癌及宮頸和肛門區(qū)高級別AIN,主要型別有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73型等,其中16和18兩型感染率最高[1,5-8]。隨著肛門區(qū)HPV感染率的增加,肛門區(qū)鱗狀細胞癌及癌前病變發(fā)生率也隨之上升，應(yīng)引起人們的關(guān)注。

本研究顯示，從肛門區(qū)正常的鱗狀上皮到低級別和高級別AIN,再到肛門區(qū)鱗狀細胞癌,HPV的總檢出率逐步增加,說明HPV感染與肛門區(qū)鱗狀細胞癌和AIN的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。

本研究低級別AIN中HRHPV檢出率為45.46%、高級別AIN中HRHPV檢出率為85.19%,肛門區(qū)鱗狀細胞癌中HRHPV檢出率為100.00%。這與WONG等[9]報道的AIN低級別病變中HRHPV檢出率為56.00%，高級別病變中HRHPV檢出率為88.00%,肛門鱗狀細胞癌中HRHPV檢出率為89.00%比較,雖然HRHPV檢出率都隨著病變程度的增加而增加,但HRHPV檢出率略有差異,這可能與HPV DNA的提取方法、檢測的方法、檢測試劑型別的覆蓋面,檢測的最低拷貝數(shù)以及組織蠟塊保存的條件和時間不同有著一定的關(guān)系。低級別AIN中HPV檢出率以低危型HPV為主,其次是高低危型HPV,最后為HRHPV,高級別AIN中HPV檢出率以HRHPV為主,其次是高低危型HPV,最后為低危型HPV,肛門區(qū)鱗狀細胞癌中HPV均為HRHPV,提示HRHPV感染是肛門區(qū)鱗狀細胞癌及大多數(shù)高級別AIN的誘發(fā)因子。

28例肛門區(qū)鱗狀細胞癌HPV型別檢出頻次前5位的為16、31、18、52、58型。20例低級別AIN中HPV型別檢出頻次前5位為6、11、16、52、31、33型；34例高級別AIN中HPV型別檢出頻次前5位為16、6、11、52、33型。28例肛門區(qū)鱗狀細胞癌組織中未出現(xiàn)低危型HPV,全部都是HRHPV,而低級別和高級別AIN中前5位檢出頻次的HPV型別中除HRHPV外,有兩種低危型HPV,說明HRHPV是致肛門區(qū)鱗狀細胞癌最主要的型別。16型在正常肛門區(qū)鱗狀上皮中未檢測出,低級別AIN中16型排名第3位,高級別AIN及肛門區(qū)鱗狀細胞癌16型排名均上升到第1位,在肛門區(qū)鱗狀細胞癌中16型檢出率39.29%(11/28),在高級別AIN中16型檢出率35.29%(12/34),均是兩者所有高危型檢出率最高的型別。因此,高危16型是肛門鱗狀細胞癌和高級別AIN中最主要的致癌、致瘤型別,因此,臨床肛腸科和皮膚科醫(yī)師對感染了高危16型的低級別AIN患者應(yīng)給予密切觀察,對感染了高危16型的高級別AIN及肛門區(qū)鱗狀細胞癌除切除病灶外,應(yīng)定期復(fù)查HRHPV并密切隨訪,以防病變復(fù)發(fā)。

從發(fā)病年齡來看,肛門區(qū)鱗狀細胞癌患者中位發(fā)病年齡為61.96歲,而低級別AIN患者中位發(fā)病年齡為43.85歲,高級別AIN患者中位發(fā)病年齡為48.27歲,低級別和高級別AIN是肛門區(qū)鱗狀細胞癌的前期病變,與肛門區(qū)鱗狀細胞癌患者中位發(fā)病年齡比較相差13～18歲。男、女40歲以上均逐步進入肛門區(qū)鱗狀細胞癌發(fā)病的高峰階段,這與宮頸癌患者發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化的趨勢有所不同[10-11]。可以考慮將40歲以后的高危人群作為肛門區(qū)鱗狀細胞癌的篩查人群,對他們開展HRHPV檢測,如果HRHPV陽性,建議行細胞學(xué)及P16/Ki-67雙染檢查。如細胞學(xué)及P16/Ki-67雙染檢查有一項陽性,建議行肛門鏡檢查,必要時活檢,根據(jù)活檢報告,確定下一步治療方案。如細胞學(xué)及P16/Ki-67雙染檢查都陰性,而高危16型HPV檢測陽性感染者,也應(yīng)對其進行跟蹤隨訪觀察。

總之,隨著自然人群中HPV感染率的增加,肛門區(qū)鱗狀細胞癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢,目前,肛門區(qū)鱗狀細胞癌的發(fā)生率還相對較低,但近年來,該病在兩性群體中的發(fā)生率正以每年約2%的速度逐年遞增。男男同性戀及HIV檢測陽性者,患AIN及肛門區(qū)鱗狀細胞癌的風(fēng)險較高。因肛門區(qū)癌與宮頸癌具有相同發(fā)病因素,女性如為宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅲ級病變者發(fā)生肛門區(qū)癌的風(fēng)險性明顯增加,進一步提示這兩種癌具有共同的致病因素,即高危型持續(xù)性HPV感染所致[10-12]。年齡在40歲以上的HPV16型感染者發(fā)生肛門區(qū)鱗狀細胞癌的可能性最高,而宮頸高危型HPV陽性的女性,肛門部位感染高危型HPV的風(fēng)險高出一般女性3倍以上。在高危人群中檢測HPV DNA,特別是檢查HRHPV、細胞學(xué)和P16/Ki-67雙染,對發(fā)現(xiàn)高級別AIN非常有用,值得在臨床上推廣[13]。對高危人群——男男同性戀及HIV檢測陽性者、年齡在40歲以上的HPV16型感染者及宮頸高級別CIN有HRHPV陽性的女性,開展以高危型HPV、細胞學(xué)及P16/Ki-67雙染檢查是非常必要的,這樣肛腸科和皮膚科醫(yī)師就可有的放矢地對高風(fēng)險患者實行重點檢測和隨訪,以便盡早地發(fā)現(xiàn)AIN患者,把疾病阻止在癌前病變階段,造福于廣大肛門區(qū)鱗狀細胞癌的患者[2-4,14-16]。

4 結(jié) 論

HRHPV感染與高級別AIN及鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),對高危人群開展肛門區(qū)HRHPV檢測、細胞學(xué)和P16/Ki-67雙染檢查,有利于肛門區(qū)癌前病變患者實現(xiàn)早診、早治。