牙鲆魚片冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)降解規(guī)律及預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

徐永霞 李 濤 馮 媛 曲詩(shī)瑤 趙洪雷 謝 晶 李學(xué)鵬* 勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧錦州121013 2 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 重慶400715 3 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306）

牙鲆 （Paralichthys olivaceus），俗稱牙片、偏口、平目等[1]，為冷溫性、底棲型海水魚類，主要分布在南、北美洲的東西岸，以及亞洲地區(qū)的渤海、黃海、東海和南海，是中國(guó)、日本及韓國(guó)等的重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類[2]。牙鲆魚肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，含有豐富的水分和蛋白質(zhì)，是做生魚片的上等材料，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，市場(chǎng)前景十分廣闊。

蛋白質(zhì)是魚類等水產(chǎn)品中最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，通常會(huì)因貯藏過(guò)程中多種環(huán)境因素的影響而發(fā)生分解。蛋白質(zhì)降解是魚肉貯藏和加工過(guò)程中一個(gè)重要的生化變化，一方面會(huì)導(dǎo)致其肉質(zhì)的松散，另一方面也會(huì)引起風(fēng)味品質(zhì)的劣變。魚類在低溫貯藏過(guò)程中，由于內(nèi)源酶的作用會(huì)導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生小分子肽類、氨基酸等中間產(chǎn)物；同時(shí)，微生物的代謝產(chǎn)生了各種酶，肌肉蛋白質(zhì)及其中間產(chǎn)物在這些酶的作用下被進(jìn)一步分解，生成氨及胺類、硫化物、醛、醇和酸等揮發(fā)性產(chǎn)物，使魚體氣味劣變，產(chǎn)生腥臭味[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫、甲基硫醇和二甲基硫是冷藏鱈魚在腐敗高級(jí)階段產(chǎn)生硫化物異味的原因，這些揮發(fā)性硫化物可能是魚肉中游離的半胱氨酸和蛋氨酸經(jīng)微生物降解產(chǎn)生[5]。由此可見(jiàn)，魚類等水產(chǎn)品的品質(zhì)劣變與肌肉蛋白質(zhì)降解之間存在密切聯(lián)系。

本研究對(duì)牙鲆魚片在不同貯藏溫度下的揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、TCA-可溶性肽、游離氨基酸含量以及菌落總數(shù)的變化進(jìn)行測(cè)定，探究魚片貯藏過(guò)程中的蛋白質(zhì)降解規(guī)律，并在此基礎(chǔ)上建立基于蛋白質(zhì)降解指標(biāo)的貨架期預(yù)測(cè)模型，以期為牙鲆魚冷藏過(guò)程中品質(zhì)的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牙鲆（購(gòu)于錦州市林西街水產(chǎn)市場(chǎng)），鮮活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，每尾重約600～800 g。

三氯乙酸、氫氧化鈉、Folin-酚試劑、茚三酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB135-S 電子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；900 型自動(dòng)封口機(jī)，溫州市德?tīng)枡C(jī)器有限公司；ecatorTM蛋白消化儀，瑞典Foss 公司；Kjeltec 8400 型全自動(dòng)定氮儀，瑞典Foss 公司；Biofuge stratos 臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；T25 高速分散機(jī)，德國(guó)IKA 公司；UV-2550 分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 鮮活的牙鲆，擊打頭部致死，去皮后取背部肌肉，去離子水洗凈、瀝干，在無(wú)菌操作臺(tái)上將切好的魚片裝入無(wú)菌蒸煮袋，用封口機(jī)空氣密封包裝后分別置于-2，0，4，7，10 ℃冰箱中貯藏。

1.3.2 感官評(píng)價(jià) 參考表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)魚片進(jìn)行感官評(píng)定。評(píng)分小組由7 名經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練的人員組成（3 男4 女），人員固定，分別對(duì)魚片的色澤、氣味以及彈性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以魚片的感官評(píng)分平均值作為感官評(píng)價(jià)結(jié)果。

表1 牙鲆魚片感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of Paralichthys olivaceus fillets

1.3.3 菌落總數(shù)測(cè)定 根據(jù)GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[6]中描述的方法，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落總數(shù)。

1.3.4 TCA-可溶性肽測(cè)定 準(zhǔn)確稱取3.00 g 絞碎的魚肉樣品，加入27 mL 5%的TCA 溶液，均質(zhì)后在4 ℃下靜置1 h，然后在5 000 g 離心10 min，取上清液用Lowry 法測(cè)定可溶性肽含量。

1.3.5 TVB-N 值測(cè)定 參考FOSS 應(yīng)用子報(bào)中《鮮魚和凍魚中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[7]，單位用mg N/100 g 魚肉表示。

1.3.6 游離氨基酸含量測(cè)定 采用茚三酮比色法測(cè)定游離氨基酸的含量[8]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Origin8.5 軟件和SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖以及方差分析，所得數(shù)據(jù)為3 次結(jié)果的平均值，P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 感官評(píng)定

牙鲆魚片在不同溫度貯藏條件下的感官評(píng)定結(jié)果如圖1所示，由圖可知，魚片的感官分值均隨貯藏時(shí)間的增加而顯著下降（P＜0.05）。新鮮牙鲆色澤鮮明，肌肉組織緊致富有彈性，肌肉切面帶有光澤，具有海水魚固有的氣味。隨著貯藏時(shí)間的增加，肌肉彈性、色澤以及氣味均變差。-2 ℃和0 ℃貯藏過(guò)程中的魚肉樣品感官品質(zhì)明顯比4 ℃、7 ℃以及10 ℃樣品高，貯藏溫度與感官評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明低溫貯藏能更有效地延緩魚片感官品質(zhì)的下降。據(jù)報(bào)道，冷藏魚肌肉軟化的主要原因是蛋白酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)尤其是V 型膠原蛋白質(zhì)的分解所致[9]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉內(nèi)部蛋白質(zhì)在內(nèi)源及外源酶的作用下逐漸分解成為醇類、醛類、酮類、有機(jī)酸及氨、胺類、硫化物和其它小分子產(chǎn)物，導(dǎo)致肉體色澤逐漸暗淡，肌肉逐漸松散、彈性變差，固有氣味逐漸消失并出現(xiàn)腐敗臭味，嚴(yán)重影響其感官品質(zhì)[10]。

2.2 菌落總數(shù)的變化

魚類等水產(chǎn)品的腐敗主要是由微生物作用引起的。微生物的代謝產(chǎn)生了各種酶，魚肉蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)在這些酶的作用下被進(jìn)一步分解，生成氨及胺類、硫化物和醛類等揮發(fā)性化合物，使魚體產(chǎn)生令人不愉快的氣味和腥臭味[3-4]。因此，貯藏過(guò)程中微生物數(shù)量的變化可直接反映魚肉降解腐敗的進(jìn)程[11]。由圖2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，5 組樣品的菌落總數(shù)均呈顯著的線性增加趨勢(shì)，且貯藏溫度越高菌落總數(shù)增長(zhǎng)速度越快（P＜0.05）。其中10 ℃樣品組微生物生長(zhǎng)速度最快，貯藏7 d 左右時(shí)菌落總數(shù)達(dá)到了二級(jí)鮮度的標(biāo)準(zhǔn)[6 lg（CFU/g）]，其次是7，4，0 ℃樣品組，-2 ℃樣品組微生物生長(zhǎng)最慢，在貯藏15 d 才超過(guò)可食用限度，這表明低溫貯藏能有效抑制牙鲆魚體內(nèi)微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)貯藏的貨架期。

圖1 不同貯藏溫度下魚片感官評(píng)分的變化Fig.1 Changes in sensory value of fillets at different storage temperatures

圖2 不同貯藏溫度下魚片菌落總數(shù)的變化Fig.2 Changes in TVC of fillets at different storage temperatures

2.3 TVB-N 含量的變化

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是反映魚肉蛋白質(zhì)在酶和微生物作用下分解形成氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)的含量[12]，TVB-N 值是判斷魚類腐敗程度的重要指標(biāo)。根據(jù)GB/T 18108-2008 規(guī)定，海水魚的可食用標(biāo)準(zhǔn)為TVB-N 值≤30 mg N/100 g。不同貯藏溫度下牙鲆魚片的TVB-N 含量隨貯藏時(shí)間的變化情況如圖3所示，由圖可知，新鮮牙鲆魚片的初始TVB-N 含量為8.5 mgN/100 g，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度下冷藏的樣品TVB-N 值均呈上升趨勢(shì)，且貯藏溫度與TVB-N 值的增速呈正相關(guān)，其中，7 ℃、10 ℃貯藏的魚片TVB-N 值上升速度顯著高于其它組（P＜0.05），4 ℃貯藏樣品TVBN 值上升速度次之，-2 ℃和0 ℃貯藏的樣品TVBN 值上升速度較為緩慢。這說(shuō)明貯藏溫度是影響蛋白質(zhì)降解速度的關(guān)鍵指標(biāo)之一，較低的溫度能很好地抑制魚肉內(nèi)源酶的活性和微生物的生長(zhǎng)繁殖速度，從而減緩蛋白質(zhì)等的降解速度。

2.4 TCA-可溶性肽含量的變化

蛋白質(zhì)分解會(huì)形成大量肽，可溶性肽含量的變化趨勢(shì)可以在一定程度上反映出蛋白質(zhì)的分解情況[13]，其值越高，魚肉中的蛋白質(zhì)分解程度越嚴(yán)重。牙鲆魚片在不同溫度貯藏過(guò)程中TCA 可溶性肽含量的變化如圖4所示。在0 天時(shí)TCA 可溶性肽的含量為47.15 μg/mL，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，5組樣品的TCA-可溶性肽含量均逐漸上升，且不同溫度處理組之間的可溶性肽含量差異顯著 （P＜0.05），說(shuō)明溫度對(duì)TCA-可溶性肽的影響顯著，貯藏溫度越高，可溶性肽含量增長(zhǎng)速率越快。其中-2 ℃和0 ℃貯藏樣品中TCA-可溶性肽含量上升較為緩慢，可能是由于低溫抑制了微生物的生長(zhǎng)和蛋白酶的活性，使蛋白質(zhì)的降解速度變慢，從而減緩了TCA-可溶性肽含量的增長(zhǎng)。

2.5 游離氨基酸含量的變化

魚類在低溫貯藏過(guò)程中，由于內(nèi)源酶和微生物的作用會(huì)導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生一系列小分子肽、氨基酸等中間產(chǎn)物，尤其是微生物產(chǎn)生的一些氨基酸脫羧酶的作用[14]，使肌肉中氨基酸含量增加，氨基態(tài)氮和游離氨基酸含量可一定程度上反映蛋白質(zhì)降解情況，其含量過(guò)高，表明魚體鮮度變差[15]。不同貯藏溫度下牙鲆魚片中游離氨基酸總量隨貯藏時(shí)間的變化情況如圖5所示，由圖可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉中游離氨基酸的含量均呈明顯的上升趨勢(shì)（P＜0.05），且貯藏溫度越高，游離氨基酸的含量上升速度越快，可能是由于在較高貯藏溫度下，魚肉中微生物生長(zhǎng)繁殖較快，其新陳代謝產(chǎn)生的各種酶類數(shù)量以及酶活性也會(huì)顯著增加，從而使肌肉蛋白質(zhì)分解更加迅速。

圖3 不同貯藏溫度下魚片TVB-N 值的變化Fig.3 Changes in TVB-N content of fillets at different storage temperatures

圖4 不同貯藏溫度下魚片TCA-可溶性肽含量的變化Fig.4 Changes in TCA-soluble peptide content of fillets at different storage temperatures

圖5 不同貯藏溫度下魚片游離氨基酸含量的變化Fig.5 Changes in free amino acids content of fillets at different storage temperatures

3 牙鲆貯藏過(guò)程中品質(zhì)變化的動(dòng)力學(xué)模型

3.1 反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定

食品品質(zhì)的變化可以用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型來(lái)描述，且大多數(shù)食品的品質(zhì)變化與時(shí)間關(guān)系都遵循零級(jí)或一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律[13]。標(biāo)準(zhǔn)的零級(jí)和一級(jí)反應(yīng)方程式分別為（1）和（2）：

式中，Ct——貯藏t 時(shí)間（d）后的某品質(zhì)指標(biāo)；C0——初始的某品質(zhì)指標(biāo)；k--反應(yīng)速率常數(shù)；t——貯藏時(shí)間（d）。

將牙鲆魚片貯藏過(guò)程中測(cè)得的各品質(zhì)指標(biāo)變化分別用零級(jí)和一級(jí)反應(yīng)方程即（1）和（2）進(jìn)行擬合，所得擬合系數(shù)如表2所示。由表可知，不同冷藏溫度下牙鲆魚片蛋白質(zhì)降解指標(biāo)的決定系數(shù)R2值各不相同，R2值越大說(shuō)明蛋白質(zhì)降解指標(biāo)與一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程擬合程度較好。各項(xiàng)指標(biāo)的一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合系數(shù)較高，因此，一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程可以很好地描述不同冷藏溫度下牙鲆魚片蛋白質(zhì)的降解情況。

3.2 動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)模型建立

用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)不同冷藏溫度下牙鲆魚片的TVB-N 值、TCA-可溶性肽含量、游離氨基酸含量及菌落總數(shù)進(jìn)行回歸擬合，可得到蛋白質(zhì)降解指標(biāo)值的反應(yīng)速率常數(shù)k，結(jié)果見(jiàn)表3。

溫度變化會(huì)顯著影響魚類等水產(chǎn)品貯藏過(guò)程中的品質(zhì)，溫度是影響魚肉貯藏過(guò)程中生化反應(yīng)速率的重要因素，反應(yīng)速率常數(shù)k 是溫度的常數(shù)，通常用阿倫尼烏斯（Arrhenius）方程來(lái)表述溫度與反應(yīng)速率之間的關(guān)系[16]：

式中，k0——頻率因子；T——絕對(duì)溫度，K；R——?dú)怏w常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；Ea——活化能，J/mol。

溫度升高，水產(chǎn)品中化學(xué)反應(yīng)速率隨之增大。在溫度變化范圍不大的情況下，Arrhenius 模型可精準(zhǔn)描述溫度與反應(yīng)速率的關(guān)系[17]。為了更好地描述溫度對(duì)水產(chǎn)品化學(xué)反應(yīng)的影響規(guī)律，通常將Arrhenius 方程與水產(chǎn)品品質(zhì)函數(shù)相結(jié)合，表述不同溫度貯藏條件下水產(chǎn)品的品質(zhì)變化，求得各品質(zhì)指標(biāo)的活化能，建立基于不同貯藏溫度的水產(chǎn)品貨架期預(yù)測(cè)模型[18]。本研究將不同冷藏溫度下得到的牙鲆魚片蛋白質(zhì)降解各指標(biāo)值的反應(yīng)速率常數(shù)k 值用Arrhenius 方程進(jìn)行擬合，計(jì)算出各指標(biāo)的Ea 和k0值，并根據(jù)確定的反應(yīng)級(jí)數(shù)方程，建立相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)模型，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 零級(jí)與一級(jí)熱力學(xué)反應(yīng)方程擬合系數(shù)Table 2 Fitting coefficients of zero order and first-order thermodynamic reaction equations

表3 牙鲆蛋白降解一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程參數(shù)Table 3 The first dynamic equation parameters of Paralichthys olivaceus protein degradation

表4 牙鲆蛋白降解動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)模型Table 4 Dynamic prediction model of Paralichthys olivaceus protein degradation

4 動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證和預(yù)測(cè)

為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，將牙鲆魚片在1，3 ℃下貯藏4 d，測(cè)得的TVB-N、TCA 可溶性肽、游離氨基酸含量以及菌落總數(shù)的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差見(jiàn)表5。由表可知，所建立的蛋白質(zhì)降解預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值偏差均在±10%以內(nèi)，說(shuō)明牙鲆魚片的實(shí)際貨架期與建立模型后預(yù)測(cè)的貨架期較為接近，因此TVB-N 模型、TCA-可溶性肽模型、游離氨基酸模型以及菌落總數(shù)模型均能較好地預(yù)測(cè)冷藏溫度下牙鲆魚片的蛋白質(zhì)降解過(guò)程和貨架期。其中TVB-N 值的相對(duì)誤差分別為8.6%和6.0%，略高于其它指標(biāo)在這兩個(gè)溫度下的相對(duì)誤差，而菌落總數(shù)和TCA-可溶性肽的預(yù)測(cè)值更接近實(shí)際值，因此菌落總數(shù)和TCA-可溶性肽預(yù)測(cè)模型能更好地預(yù)測(cè)牙鲆魚片在-2～10 ℃貯藏過(guò)程中的品質(zhì)變化。

表5 牙鲆蛋白降解模型驗(yàn)證結(jié)果Table 5 The prediction model validation results of Paralichthys olivaceus protein degradation

5 結(jié)論

研究了不同貯藏溫度對(duì)牙鲆魚片蛋白質(zhì)降解情況的影響，結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牙鲆的感官指標(biāo)呈下降趨勢(shì)，TVB-N 值、TCA-可溶性肽、菌落總數(shù)以及游離氨基酸均呈上升趨勢(shì)，且溫度越高，蛋白質(zhì)降解程度越明顯，各指標(biāo)的變化遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。根據(jù)確定的TVB-N值、TCA-可溶性肽、菌落總數(shù)以及游離氨基酸預(yù)測(cè)模型系數(shù)，得到Arrhenius 方程回歸系數(shù)大于0.9，具有較高的擬合精度。經(jīng)驗(yàn)證，模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相對(duì)誤差均在±10%以內(nèi)，因此，該模型能很好地預(yù)測(cè)-2～10 ℃貯藏溫度范圍內(nèi)牙鲆魚片的品質(zhì)變化，可為預(yù)測(cè)和控制冷藏溫度下牙鲆魚片的品質(zhì)提供參考。