阿霉素誘導人食管鱗癌細胞凋亡的實驗研究

劉玟琳 馮 彤 苑亞嬌 徐建玲 蔣漢明

山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)，山東 泰安 271000

食管癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其死亡率位居世界腫瘤死因的第6位[1-3]。盡管放療、化療、手術和綜合治療等多種治療方法已用于食管癌的治療，但其5年生存率也僅為20%～30%[4-5]。我國是食管癌年齡標準化死亡率最高的國家，絕大多數(shù)食管癌為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。食管癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為進展期[6]，食管鱗癌進展主要分為5個階段，其中異型增生是其發(fā)展的關鍵[7-9]。目前化療仍是食管癌最普遍的治療方法，尤其針對于易復發(fā)型和中晚期食管癌患者[10-11]。阿霉素作為蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物具有療效好、活性強等特點，其主要通過抑制拓撲異構酶的活性，發(fā)揮抗腫瘤作用。在動物實驗和臨床應用中表現(xiàn)出較顯著的抗腫瘤效果[12-14,18-20]。研究表明，阿霉素可誘導腫瘤細胞S期阻滯，而S期是細胞周期中DNA合成和染色體復制的關鍵時期。作用于S期的阿霉素，可以有效的抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[15,17]。本實驗以人食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706作為研究對象，通過體外實驗探討阿霉素對人食管癌細胞增殖和凋亡的影響，為阿霉素抗食管癌的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人食管鱗癌KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706細胞株，分別購自中科院上海細胞庫和北納生物。KYSE450的基礎培養(yǎng)基為MEM，其它細胞基礎培養(yǎng)基為RPMI1640，所有基礎培養(yǎng)基中均添加10%的胎牛血清和100 U/mL的青鏈霉素。細胞培養(yǎng)于37 ℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.1.2藥品與試劑 阿霉素購自于Sigma公司，溶于DMSO中，制成5 mg/mL的儲備液；cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax抗體購自CST公司；內參GAPDH抗體購自Santa Cruz公司；二抗購自KPL公司；增強型CCK-8、DAPI染色液購自碧云天；Annexin V-FITC /PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、MitoScreen(JC-1)購自BD公司；BCA微量蛋白定量試劑盒購自索萊寶公司。

1.1.3儀器 全波長多功能微孔板酶標儀(PE Enspire)；流式細胞儀(BD Canto II)；離心機(Minispin)；蛋白質印跡系統(tǒng)(Bio-rad)；血細胞計數(shù)板(上海XB-K25)；尼康普通倒置顯微鏡(TS100)；尼康熒光倒置顯微鏡(Ti-S)；超凈工作臺(上海新苗SW-CJ-2F)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo-3111)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人食管癌細胞KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706，采用含10%胎牛血清的MEM或RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿置于37 ℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至培養(yǎng)皿中80%～90%時進行傳代，待細胞生長到對數(shù)期進行后續(xù)實驗。

1.2.2ADM敏感細胞株篩選 取對數(shù)生長期食管癌細胞KYSE180、KYSE450、KYSE510、EC9706 3×104細胞/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，過夜。阿霉素濃度設置為5 000，2 000，1 000，500，250，125，62.5和31.25 ng/mL，并設置0 ng/mL為對照組，每個濃度4個復孔。48 h后，吸盡培養(yǎng)基，加入含CCK-8(5 mg/mL)的新鮮培養(yǎng)基，每孔100 μL，37 ℃避光孵育1.5 h，波長450 nm處測定各組的吸光度，計算IC50，實驗重復3次，取平均值。IC50最低的細胞為最敏感細胞株。細胞增殖抑制率=(對照組吸光度-處理組吸光度)/對照組吸光度×100%。

1.2.3細胞總蛋白的提取 取對數(shù)期的KYSE450和KYSE180細胞，接種于6孔板中，24 h后加入不同濃度的ADM，分別作用48 h和72 h，吸盡培養(yǎng)基，以4 ℃預冷的PBS清洗2遍，加入SDS-裂解液，提取總蛋白。

1.2.4蛋白印跡 將收集的蛋白經(jīng)定量后，等量蛋白(40 μg)經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h。分別用cleaved PARP(稀釋比1∶1 000)，cleaved caspase-3(稀釋比1∶1000)，Bax(稀釋比1∶500)和GAPDH(稀釋比1∶3000)抗體4 ℃孵育過夜，然后TBST洗膜3次，5 min/次，TBS洗膜1次，5 min/次，加入HRP偶聯(lián)的二抗，室溫封閉1 h，再次重復上述洗膜步驟，最后顯影、定影曝光后分析結果。

1.2.5細胞形態(tài)學變化 取對數(shù)生長期的KYSE450細胞接種至6孔板中，過夜。加入不同濃度的ADM，48 h后觀察，并拍照記錄。

1.2.6DAPI染色 ADM處理48 h后的KYSE450細胞，經(jīng)預冷的PBS清洗2次后加入-20℃預冷的甲醇/丙酮固定液(體積比1∶1)，PBS清洗2次，加入DAPI染色液，避光孵育10 min，再次用PBS清洗，置于熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)，拍照記錄。

1.2.7細胞周期檢測 取對數(shù)期生長的KYSE180和KYSE450細胞接種于小皿中，ADM處理24 h后，收集細胞，并用1 mL PBS清洗2遍。加入預冷的75%乙醇懸浮，置于搖床上，4 ℃固定過夜，離心后PBS洗滌2遍。加入終濃度為50 mg/L的RNase A溶液，于37 ℃水浴20 min，再加入相同工作濃度的PI試劑，30 min避光孵育，最后上機檢測。

1.2.8線粒體膜電位JC-1檢測 收集不同濃度ADM處理24 h后的KYSE450細胞，根據(jù)BDTMMitoscreen說明，37 ℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育10～15 min，上機檢測。

1.2.9細胞凋亡檢測 收集不同濃度ADM處理48 h的KYSE450細胞， 4℃預冷的PBS清洗2遍，根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明，避光孵育15 min，然后上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 ADM抑制食管鱗癌細胞增殖

為了驗證ADM對食管鱗癌細胞增殖的影響，我們采用不同濃度的ADM作用48 h。結果表明，ADM對各食管鱗癌細胞株增殖具有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴性。當ADM濃度達到250 ng/L時，除EC9706外，細胞增殖抑制率均超過50%。ADM對KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別97.46、111.21、168.63和368.53 ng/mL。其中KYSE450最敏感(表1，圖1A)。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的KYSE450細胞生長飽滿，貼壁均勻，細胞邊緣完整清晰。隨著ADM濃度的增加，皺縮的細胞增多，高濃度組多數(shù)細胞變圓，部分細胞未貼壁懸浮于培養(yǎng)基中(圖1B)。以上結果表明ADM呈劑量依賴性的抑制食管鱗癌細胞增殖，并誘導細胞死亡。

表1 ADM抑制人食管鱗癌細胞增殖

A:ADM抑制人食管鱗狀細胞癌細胞增殖對KYSE450細胞形態(tài)變化的影響(× 400)。

2.2 ADM對KYSE450細胞和KYSE180細胞周期的影響

不同濃度ADM處理24 h后的KYSE180和KYSE450細胞S期和G2期細胞比例增加，G1期減少。KYSE180細胞中，對照組S期和G2期的細胞比例分別為20.11%和4.49%，當ADM濃度為187.5 ng/mL時，S期和G2期細胞比例上升至29.9%和64.9%。此后，隨著ADM濃度增加，G2期細胞比例下降，S期細胞比例上升。當ADM濃度為3 000 ng/mL時，G2期細胞比例下降至為4.81%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。S期細胞比例為44.12%，顯著高于對照組；而在KYSE450細胞中，ADM濃度187.5 ng/mL時，S期細胞比例上升至68.36%，隨著ADM濃度增加，S期細胞比例雖有所下降但仍顯著高于對照組(圖2A,B)。以上結果表明，ADM可誘導食管癌KYSE180和KYSE450細胞S期阻滯，在一定濃度范圍內，也伴隨G2期阻滯。

A & B:阿霉素影響KYSE450、KYSE180細胞周期分布<0.01 vs 對照組)。

2.3 ADM對KYSE450和KYSE180線粒體膜電位的影響

為了驗證ADM對KYSE450和KYSE180線粒體膜電位的影響，我們利用JC-1探針檢測了不同濃度ADM處理后細胞線粒體膜電位的變化。結果表明，對照組中KYSE450和KYSE180細胞低線粒體膜電位的細胞比率僅為4.77%、1.83%，隨著ADM濃度增加，線粒體膜電位下降的細胞比例逐漸增加。當ADM濃度達到3 000 ng/mL時，低線粒體膜電位的細胞比率分別達到了9.83%和8.20%(圖3A～D)，但差異無統(tǒng)計學意義。說明ADM并不影響KYSE450和KYSE180細胞的線粒體膜電位。

2.4 ADM誘導KYSE450凋亡

DAPI染色結果表明，對照組細胞核呈現(xiàn)圓形或橢圓形，隨著ADM濃度增加，部分細胞核皺縮，著色加深，呈現(xiàn)密度的強熒光團，有些呈新月狀聚集(圖4A,B)。Annexin V-FITC/PI雙染結果表明，ADM可顯著誘導KYSE450細胞凋亡，并呈濃度依賴性。對照組細胞凋亡率僅為6.63%,而當ADM濃度達到3 000 ng/mL時，46.6%的細胞發(fā)生了凋亡(圖4C,D)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.5 ADM對KYSE450、KYSE180細胞凋亡相關蛋白的影響

Western Blot結果顯示，隨著ADM處理，KYSE450和KYSE180細胞內cleaved caspase-3，cleaved PARP水平顯著上升，且呈時間劑量依賴性，而Bax水平在KYSE450和KYSE180細胞中呈現(xiàn)不同的變化趨勢。在KYSE450細胞中，ADM處理可誘導Bax水平升高，而在KYSE180細胞中，Bax表現(xiàn)出下降的趨勢(圖5A～D)。以上結果表明，ADM能激活caspase-3，剪切PARP，促進KYSE450和KYSE180細胞凋亡。

A & B:不同濃度的ADM對KYSE450細胞線粒體膜電位的影響；

A & B:DAPI染色顯示ADM誘導的KYSE450細胞凋亡(×400)；

A & B:ADM對KYSE180細胞凋亡相關蛋白表達的影響；C & D:ADM對KYSE450細胞凋亡相關蛋白表達的影響。

3 討 論

食管癌以淋巴轉移為主，進行性吞咽困難為其典型表現(xiàn)，易侵犯氣管、喉返神經(jīng)、頸交感神經(jīng)等周圍組織器官，出現(xiàn)呼吸困難、疼痛嗆咳等癥狀，難以耐受，終末期呈惡病質狀態(tài)[16]。盡管外科手術和化療能提高食管癌生存率，但由于廣泛轉移，復發(fā)和耐藥的存在，5年生存率僅有20%～30%[4]。

腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展與細胞生長周期密切關聯(lián)，S期是DNA合成關鍵期，從G1期進入S期意味著DNA復制的開始，細胞增殖活動的進行[15,17,20]。阿霉素屬于蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，作為一種拓撲異構酶抑制劑，主要通過抑制DNA復制，誘導腫瘤細胞死亡[21]。此外，阿霉素還可通過多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用，如產(chǎn)生自由基，使DNA鏈斷裂；影響轉錄過程；影響細胞周期等。雖然阿霉素對各時期的細胞均有抑制作用，但S期的細胞對阿霉素最為敏感。本實驗結果表明，ADM可以阻滯KYSE180和KYSE450細胞于S期。與對照組相比，較高濃度下的阿霉素處理KYSE180和KYSE450細胞，S期細胞比率均升高，且KYSE180細胞升高更加明顯，說明ADM更易誘導KYSE180細胞S期阻滯。腫瘤的發(fā)展不僅受細胞增殖過度的影響，也與細胞凋亡受抑有關[17]。本實驗通過DAPI染色和Annexin V-FITC/PI雙染均證實ADM可顯著誘導KYSE450細胞凋亡，且呈濃度依賴性。在3 000 ng/mL的ADM作用48 h后，46.6%的KYSE450細胞發(fā)生了凋亡。在不同類型的腫瘤中細胞凋亡的方式和機制不完全相同。以往研究表明，ADM可以降低肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞的線粒體膜電位，誘導細胞凋亡[22-27]，但本實驗結果表明，在食管鱗癌KYSE180和KYSE450細胞中，高濃度ADM雖然可以在一定程度上降低線粒體膜電位，但差異無統(tǒng)計學意義，說明ADM誘導的食管鱗癌細胞凋亡可能并不需要線粒體膜電位的下降。其原因我們推測可能與腫瘤的類型有關。在細胞凋亡過程中，bcl-2家族和caspase家族最受關注[28]。楊建勇等發(fā)現(xiàn)，Bax基因能夠增加腫瘤細胞對阿霉素的敏感性，可促進凋亡基因發(fā)揮作用[29]。本實驗發(fā)現(xiàn)，阿霉素可上調Bax的水平，并激活KYSE450細胞內caspase-3，進而對PARP進行剪切，最終導致細胞凋亡。然而在KYSE180細胞中，ADM誘導的細胞凋亡伴隨著Bax水平的下降，具體機制還需進一步揭示。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，ADM可顯著抑制食管鱗癌的細胞增殖，誘導食管鱗癌細胞S期阻滯，并通過激活caspase-3誘導細胞凋亡。本研究為ADM用于食管鱗癌治療提供了實驗基礎。本研究僅限于體外培養(yǎng)的食管鱗癌細胞株，體內的藥效仍需進一步探究。