浙貝母黑斑病致病菌的分離鑒定及分子檢測

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

貝母（Fritillaria.sp）為多年生草本藥用植物，藥典收藏的有川貝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）、伊貝母（Fritillaria pallidiflora Schrenk）、平貝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）和浙貝母 （Fritillaria thunbergii Miq.）等8種。川貝母主產(chǎn)于四川、云南、甘肅等地，伊貝母主產(chǎn)于新疆、黑龍江等地，浙貝母是著名的“浙八味”之一，浙江、江西、湖南等省份有大面積栽培，浙江省主要分布在磐安、東陽、鄞縣、縉云等縣市，有300多年的種植歷史，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入的主要來源[1]。近年來，隨著種植面積的不斷擴大，特別是長期連作和鱗莖營養(yǎng)繁殖，導(dǎo)致貝母病害日益突出，嚴(yán)重影響貝母的產(chǎn)量和質(zhì)量[2-3]。其中黑斑病是貝母的重要病害之一，主要危害葉片，浙江產(chǎn)區(qū)常于3月下旬開始發(fā)病，發(fā)病初期為葉頂端出現(xiàn)黃褐色水漬狀病斑，病部與健康部有明顯界限，后向基部蔓延，直至植株地上部分提早枯死，地下鱗莖瘦小，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，特別是多雨年份病害更加嚴(yán)重[3-4]；同時，黑斑病以菌絲及分生孢子極易在被害植株和病葉上越冬，第二年會再次浸染危害[5-6]。因此，貝母黑斑病的防控是保障貝母產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點[7]。

關(guān)于貝母黑斑病致病菌種類鑒定的研究報道極少，僅有的資料均主要依據(jù)真菌的菌落、菌絲及孢子形態(tài)、大小、色澤等形態(tài)學(xué)特征進行鑒定。例如，研究發(fā)現(xiàn)浙貝母黑斑病由半知菌亞門的交鏈孢菌（Alternaria alternate（Friss.） Keissler）侵染所致，病菌菌絲隨病殘組織遺落在土中越冬，第二年再次侵染貝母[3]。伊貝母黑斑病的致病菌為鏈格孢屬真菌，但具體的種類未鑒定。而鏈格孢屬真菌種類繁多，近緣種的菌落、菌絲和孢子形態(tài)相似，難以依靠上述特征加以區(qū)分[8]。分子生物學(xué)方法是目前普遍采用的真菌鑒定方法，真菌分類學(xué)家Woudenberg提出了以鏈格孢屬真菌新的分子標(biāo)準(zhǔn)作為種水平的界定標(biāo)準(zhǔn)[9]。但至今未見對貝母黑斑病病原真菌的分子鑒定研究報道，貝母黑斑病是由鏈格孢菌還是其他鏈格孢屬真菌侵染造成，亦或是多種鏈格孢屬真菌侵染均可致病，至今尚不明確。為此，本研究擬采用多個基因片段作為DNA條形碼，對田間采集的浙貝母黑斑病病原真菌進行分子鑒定，為貝母黑斑病的防治及病原真菌的流行病學(xué)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣本收集 2015至2018年4年間，本實驗室從浙江省磐安縣新渥鎮(zhèn)彈上村、新渥村和冷水鎮(zhèn)白巖村等地陸續(xù)采集疑似浙貝母黑斑病病葉共12批次，用于分離純化病原菌。見表1。

1.1.2主要試劑 基因組DNA提取試劑盒購自自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（批號：9002-93-1）；2×Taq Master Mix（含染料）購自上海生工生物工程公司（批號：F715KA2424）；DNA的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、翻譯延伸因子-1α（translation elongation factor-1α，TEF-1α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，G3PDH） 和RNA聚合酶Ⅱ亞基（the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzymeⅡ，RPB2）的引物均由上海生工生物工程公司合成。見表2。

表1 浙貝母病株采集信息Tab.1 Information of disease strains of Fritillaria thunbergii Miq collection

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1病原真菌的分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定 采用植物患病組織分離法對病原真菌進行分離[9]，將分離菌株純化為單一菌種，根據(jù)其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落、菌絲和分生孢子等形態(tài)特征，參照文獻[8]對病原真菌進行形態(tài)學(xué)鑒定，并保存于PDA斜面上備用。

1.2.2病原真菌的分子鑒定 選取經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為鏈格孢屬（Alternaria genus）的真菌進行分子鑒定[2-3]。采用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用真菌核糖體DNA ITS通用引物、TEF-1α、G3PDH和RPB2基因的引物分別對病原真菌進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL：2×Taq Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，ddH2O 9.5μL。各引物的PCR反應(yīng)條件如表3。

PCR擴增產(chǎn)物于江蘇金唯智生物科技公司雙向測序，采用Codoncode Aligner軟件拼接，以 GenBank數(shù)據(jù)庫 （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/） 對序列進行BLAST比對分析，利用MEGA 7.0.26軟件采用鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用1 000次重復(fù)Bootstrap檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的支持率，以支持率≥50%為閾值，作為成功鑒別物種的界限[10]。

表3 各引物的PCR反應(yīng)條件Tab.3 PCR reaction conditions of each primer

1.2.3病原真菌的致病性檢測 采用活體盆栽摩擦接種法檢測其致病性。用接種針刺傷健康浙貝母幼苗的根部，將從病株上分離、純化的菌株打成菌餅后覆于刺傷部位，并以鋁箔紙覆蓋，將接種空白PDA的刺傷植株作為對照組，重復(fù)4組。接種后的植株于室溫培養(yǎng)，觀察、記錄植株發(fā)病情況，并從發(fā)病部位再次分離病原真菌，并檢測是否為同一真菌[11]。

2 結(jié)果

2.1病原真菌的分離純化和形態(tài)學(xué)鑒定 經(jīng)分離純化獲得34株菌株。根據(jù)分離物在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子形態(tài)的顯微觀察，其中15株菌株屬于鏈格孢屬真菌，其余為鐮刀菌（Fusarium）、葡萄孢菌（Botrytis）、毛殼菌（Chaetomium）等其他菌種。15株鏈格孢屬真菌菌株中，11株菌株的形態(tài)學(xué)特性如圖1所示，菌落為圓形、毛氈狀，菌落初期為白色，后漸變?yōu)榍嗪稚梁诤稚?，邊緣灰白色，菌落背面呈黃褐色；菌絲生長旺盛，在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲有隔，無色或淡褐色、半透明，孢子鏈多為短分枝，具1～5個孢子；分生孢子單生或短鏈生，棕褐色，大多為倒棍棒形，縱橫皆有隔膜，多為橫隔膜，短喙或無喙。將各菌株初步定名為分離物1-1～1-11，初步鑒定為鏈格孢菌（Alternaria alternata，A.alternata）。另4株菌株的形態(tài)學(xué)特性如圖2所示，菌落為近圓形、細毛氈狀，菌落初期為灰白色，后漸變?yōu)榍嗪稚梁诤稚笃诰洚a(chǎn)生黑色色素；菌絲有隔，無色或淡褐色、半透明，孢子鏈多為短分枝，具1～5個孢子；分生孢子單生或短鏈生，黃褐色，顏色較另外11株菌株稍淺，呈倒棍棒形，有縱橫隔膜，縱隔膜較另外11株菌株更多，短喙或無喙。初步定名為分離物2-1～2-4，初步鑒定為細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima，A.tenuissima）。

圖1 分離物1-1～1-11的形態(tài)學(xué)特性Fig.1 Morphological characteristics of the isolates 1-1～1-11

圖2 分離物2-1～2-4的形態(tài)學(xué)特性Fig.2 Morphological characteristics of the isolates 2-1～2-4

2.2不同菌落DNA序列的變異分析 分離物1-1～1-11 PCR擴增的ITS、TEF-1α、G3PDH、RPB2片段長度分別均為562bp、261bp、945bp和645bp。見圖3。經(jīng)比對分析，分離物1-1～1-11各片段的DNA序列完全相同，判定來源于同一菌種，命名為分離物1。分離物2-1～2-4的相應(yīng)片段長度分別均為566bp、282bp、942bp和644bp。見圖3。經(jīng)比對分析，4個分離物同一DNA的序列完全相同，來源于同一菌種，命名為分離物2。

圖3 ITS、TEF-1α、G3PDH及RPB2序列PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of ITS，TEF-1α，G3PDH and RPB2 sequences

2.3鏈格孢屬真菌的多序列比對分析 將分離物1和分離物2與GenBank數(shù)據(jù)庫中常見鏈格孢屬真菌的ITS、TEF-1α、G3PDH及RPB2序列進行多序列比對。

2.3.1ITS序列的同源性比對 分離物1的ITS序列與GenBank中鏈格孢菌（登錄號：MG182428）、細極鏈格孢菌（登錄號：MF356594）、蕓苔鏈格孢菌（登錄號：MG733697）等16條序列的同源性均為100%；與蔥鏈格孢菌（登錄號：KU293590）、蘋果鏈格孢菌（登錄號：KU293580）同源性為99.82%；與長柄鏈格孢菌（登錄號：MK675101）、鴨梨鏈格孢菌（登錄號：MK675102）、喬木交鏈孢菌 （登錄號：MK460966）、甘藍鏈格孢菌（登錄號：MK311298）同源性為99.64%。

分離物2的ITS序列與鏈格孢菌 （登錄號：MK972905）、細極鏈格孢菌（登錄號：MK967997）、長柄鏈格孢菌（登錄號：MK675101）、鴨梨鏈格孢菌（登錄號：MK675102）等102條序列同源性均為100%。分離物1、2之間同源性為98.23%，上述鏈格孢屬真菌的ITS序列存在5個變異位點，560個保守位點，變異比例為0.88%。

2.3.2TEF-1α序列的同源性比對 分離物1的TEF-1α序列與鏈格孢菌（登錄號：KY175227）、細極鏈格孢菌 （登錄號：LT707524）等12條序列的同源性均為100%；與長柄鏈格孢菌（登錄號：KY542121）同源性為98.89%；與喬木交鏈孢菌 （登錄號：KY965831）為98.53%；與甘藍鏈格孢菌 （登錄號：MH424919）為88.21%；與蕓苔鏈格孢菌 （登錄號：KC584641）為86.55%。

分離物2的TEF-1α序列與細極鏈格孢菌 （登錄號：LT707524）、鏈格孢菌（登錄號：LC136862）等15條序列的同源性均為100%；與喬木交鏈孢菌（登錄號：KY965831）同源性為98.58%；與長柄鏈格孢菌（登錄號：KY549590）為98.63%。分離物1、2之間同源性為100%，上述鏈格孢屬真菌的TEF-1α序列存在42個變異位點，168個保守位點，變異比例為20%。

2.3.3G3PDH序列的同源性比對 分離物1的G3PDH序列與鏈格孢菌（登錄號：XM_018523704）的同源性為100%；與喬木交鏈孢菌（登錄號：XM_028650964）同源性為99.67%；與A.alternate（登錄號：LT707520）為99%。

分離物2的G3PDH序列與細極鏈格孢（登錄號：KY290574、KP851965）的同源性為100%；與A.alternate（登錄號：LT707520）同源性為99%；與蘋果鏈格孢菌（登錄號：AY762954）為99.34%。分離物1、2之間同源性為76.35%，上述鏈格孢屬真菌的G3PDH序列有7個變異位點，511個保守位點，變異比例為1.35%。

2.3.4RPB2序列的同源性比對 分離物1的RPB2序列與GenBank中鏈格孢菌 （登錄號：MG250634、KT889294）同源性均為100%；與細極鏈格孢菌（登錄號：MG013472）、長柄鏈格孢菌（登錄號：KY056664）同源性為99.17%；與喬木交鏈孢菌 （登錄號：KC584377）為98.58%；與蘋果鏈格孢菌 （登錄號：LC275237）為99.07%；與蕓苔鏈格孢菌 （登錄號：MG250626）為92.33%。

分離物2的RPB2序列與細極鏈格孢菌 （登錄號：LT707523、LC134328、LC134327、LC134326）的 同 源性均為100%；與鏈格孢菌（登錄號：LC132704）同源性為99.26%；與喬木交鏈孢菌（登錄號：MH345693）為99.05%；與蕓苔鏈格孢菌 （登錄號：KY549622）為92.37%。分離物1、2之間同源性為99.05%，上述鏈格孢屬真菌的RPB2序列存在65個變異位點，643個保守位點，變異比例為9.18%。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 選取ITS、TEF-1α、G3PDH及RPB2序列首尾相連，并引入離蠕孢屬的玉米小斑病菌（B.maydis）和稻平臍蠕孢菌（B.oryzae）作為外群構(gòu)建多序列系統(tǒng)發(fā)育樹［12］，系統(tǒng)發(fā)育樹參比菌種序列的GenBank登錄號見表4。鏈格孢屬與離蠕孢屬分為兩個大組，鏈格孢屬的大組又分為兩大支，其中侵染鏈格孢菌（A.infectoria）單獨為一支，其他鏈格孢屬聚為另一大支，分離物1與鏈格孢菌聚在一起，分離物2與細極鏈格孢菌聚在一起；同時，系統(tǒng)發(fā)育樹很好地顯示了各鏈格孢菌屬種間的親緣關(guān)系。見圖4。

2.5病原真菌的致病性測定 取分離物1和分離物2的菌餅接種健康浙貝母幼苗后，植株的發(fā)病癥狀與田間癥狀相同：葉尖卷曲枯萎，呈褐色漬狀，有黑色斑點，病部與健康部有明顯界限，菌種與接種真菌相同；對照組的浙貝母植株未出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀。見圖5。

表4 系統(tǒng)發(fā)育樹參比菌種序列的GenBank登錄號Tab.4 GenBank login number of phylogenetic tree reference strain sequence

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree

圖5 浙貝母黑斑致病性測定結(jié)果Fig.5 Results of pathogenicity determination of black spot disease of F.thunbergii

3 討論

浙貝母黑斑病是浙貝母的重要病害之一，以往的研究報道為鏈格孢菌侵染所致[4]。本研究中通過患病組織分離純化，對菌落、菌絲和孢子形態(tài)進行觀察及致病性檢測，發(fā)現(xiàn)有兩種鏈格孢屬真菌可導(dǎo)致浙貝母黑斑病，分別為鏈格孢菌和細極鏈格孢菌，其中細極鏈格孢菌系首次報道為浙貝母黑斑病的病原真菌，這為浙貝母黑斑病的研究和防治提供了新的思路。此外，本研究的成果也為浙貝母干腐病、灰霉病等其他真菌性病害致病菌的分類鑒定提供了思路。

鏈格孢屬真菌的屬級形態(tài)特征較為明顯，但僅僅根據(jù)菌絲形態(tài)和產(chǎn)孢表型難以區(qū)分鑒定到種，且其形態(tài)特征易受環(huán)境因素影響，尤其是鏈格孢小孢子種，其菌落形態(tài)差異有限。因此，近年來分子生物學(xué)技術(shù)逐漸成為當(dāng)前鏈格孢屬病原真菌分類鑒定的主要手段。Luan等[13]利用5.8S rDNA和ITS序列首次報道細極鏈格孢菌致藍莓黑斑病。Berbegal等［14］利用ITS序列首次報道鏈格孢菌致石榴黑斑病。謝紅輝［15］分析了41個鏈格孢屬種和2個匍柄霉屬種的5.8S rDNA和ITS序列，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明鏈格孢屬種間形態(tài)差異大者可以根據(jù)序列分析加以區(qū)分，而形態(tài)差異小的則不能區(qū)分。因此，在分子鑒定過程中，需要多個DNA片段同時使用，才能達到鑒定的效果[14-18]。本實驗在對分離物1和分離物2的鑒定中，利用菌落、菌絲和孢子形態(tài)觀察法亦無法準(zhǔn)確鑒定兩種真菌的種類。因此，進一步采用DNA條形碼技術(shù)進行種類鑒定，并不斷增加DNA片段的種類，最后采用ITS、TEF-1α、G3PDH和RPB2等4個序列，并對上傳至GenBank的所有鏈格孢屬真菌的相應(yīng)序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)上述幾種基因序列的變異比例在0.88%～20%。該結(jié)果表明，不同DNA序列在鏈格孢屬真菌種間的變異比例差異較大，較之ITS和G3PDH序列，RPB2和TEF-1α序列更能體現(xiàn)鏈格孢屬真菌的種間差異，與Mangwende等［16］的研究結(jié)果不謀而合，后者基于RPB2、GAPDH和TEF-1α序列對胡荽黑斑病的致病真菌進行鑒定，證實其為鏈格孢菌。Luo等[18]則利用ITS、甘油-3-磷酸脫氫酶（glycerol-3-phosphate dehyodrogenase，gpd）、內(nèi)聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase，endo-PG）和RPB2等序列鑒定中國鳶尾葉斑病病原真菌為Alternaria iridiaustralis。

分離物1與GenBank中鏈格孢菌ITS、TEF-1α、G3PDH、RPB2序列的同源性均為100%，而上述序列與其他鏈格孢屬真菌的同源性有部分未達到100%。因此，確定分離物1為鏈格孢菌。分離物2的ITS、TEF-1α、G3PDH、RPB2與GenBank中細極鏈格孢菌的同源性均為100%，與其他鏈格孢屬真菌的同源性則有部分未達到100%。因此，確定分離物2為細極鏈格孢菌。利用4個DNA片段作為條形碼可以準(zhǔn)確地將分離物1和分離物2，即鏈格孢菌和細極鏈格孢菌鑒定出來，為田間浙貝母黑斑病病原真菌的分子鑒定提供了實驗依據(jù)。從基于ITS、TEF-1α、G3PDH、RPB2序列同源性比對和多序列聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，僅憑單一序列提供的信息位點來分析某些種間差異，無法鑒定到種。而結(jié)合多個序列聯(lián)合比對的結(jié)果進行系統(tǒng)分析，可以清楚的將菌株鑒定到種，且可明確各菌種的種間親緣關(guān)系。

一般認(rèn)為，A.alternata和A.alternate均表示鏈格孢菌，但在上傳至GenBank的序列中，兩者的ITS、TEF-1α、G3PDH序列均存在顯著變異。本研究中，分離物1的ITS、TEF-1α、G3PDH序列與A.alternata的相同，RPB2序列則有一個堿基的差異，與A.alternate的則均有差異；分離物2的ITS、G3PDH、RPB2序列與細極鏈格孢菌一致，而且ITS序列與A.alternate相同，但其余3個序列均與A.alternate不同。有研究認(rèn)為，鏈格孢菌存在明顯的遺傳分化，說明鏈格孢菌可能是一個復(fù)合種[19]。因此，兩者是否為不同的種仍有待于進一步研究。目前也有報道利用鏈格孢過敏原 （Alternaria alternata major allergen，Alta1）、endo-PG、大亞基 （large subunit，LSU）、OPA10-2、OPA1-3和OPA2-1串聯(lián)序列進行鏈格孢屬真菌系統(tǒng)發(fā)育分析，以作為分類依據(jù)對鏈格孢屬進行分子鑒定[20-21]。筆者將會參考此類研究，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上增加部分DNA序列，進一步對兩種浙貝母黑斑病的致病菌進行確認(rèn)。

綜上所述，本研究證實浙貝母黑斑病的病原真菌有鏈格孢菌和細極鏈格孢菌，其中細極鏈格孢菌首次被證明可引起浙貝母黑斑病。但本研究僅對浙貝母黑斑病樣品進行了致病菌檢測，川貝母、伊貝母等其他貝母黑斑病是否也與鏈格孢菌和細極鏈格孢菌相關(guān)，仍有待于增加樣品種類、擴大樣本量進一步深入研究。