深低溫冷凍保存血小板最佳時限的研究

付凌梅，楊振宇，劉媛媛

（云南昆明血液中心 質?？疲颇?昆明 650106）

在惡性血液病患者治療中，外周血干細胞移植是最有效的方法之一，但在移植手術中由于各種原因會引起血小板等血細胞急劇減少，故在移植手術后，為了更好地控制出血，需多次輸入單采血小板，以防止患者大出血[1]。因此，保證足量的血小板供應就顯得尤為重要。單采血小板因在保存過程中容易喪失活性等原因，目前主要采取的方法是在常溫振蕩條件下保存5d[2]。過期的血小板由于功能喪失，感染細菌的可能大大增加一般被扔棄。怎樣增加血小板存活率及延長其保存期，減少血小板活化，已成為當下研究的熱點。

由于血小板的保存損傷機制十分復雜，涉及到血小板代謝的改變、活化機制等很多個方面，故冰凍保存血小板的研究工作目前尚未有突破性進展[3]，以致沒能被廣泛應用。低溫保存主要在于減低生物細胞中的酶活性，從而使細胞的代謝處于基本停止狀態(tài)[4,5]。目前還是以5%～6%DMSO作為深低溫冷凍保護劑將血小板冰凍保存在-80℃這一方法為主，因此方法能使血小板長期保存較穩(wěn)定[6]。

當下，國家還未制定冰凍血小板的質量標準及儲存期限，徐學新等[7]認為冰凍血小板保存期可達6～12月，解凍后血小板的聚集功能恢復良好。輸入冰凍保存血小板后雖然血小板計數(shù)增加不如新鮮機采血小板明顯，但出血癥狀改善明顯，止血效果優(yōu)于新鮮機采血小板[8]。當下研究表明，深低溫冰凍單采血小板對保存血小板具有很好的效果[9]。盡管冰凍保存后的血小板在數(shù)量和形態(tài)上變化不大，保存完好，但是血小板發(fā)生了明顯的活化（冰凍后血小板表面的CD62顯著升高）。與22℃條件相比，－80℃條件下冷凍血小板生物活性物質衰減的速度顯著減慢，衰減速度可能接近零。所以，冷凍保存血小板的優(yōu)勢還可能在于它能更好維持血小板胞內生物活性物質，如血小板因子、凝血因子和促凝血物質的有效活性，從而維持并提高了血小板的止血凝血功能[10]。

在歐洲對冰凍保存血小板質量控制標準中有嚴格規(guī)定：凍融后的血小板計數(shù)只要＞凍前數(shù)量的40%即視為合格[11]。本研究就是通過制備冰凍血小板，選擇在-80℃深低溫冰箱中進行保存，在保存到6月、12月時復融對血小板各項質量指標進行檢測，找到深低溫保存血小板的最佳儲存期限，指導臨床使用并期望通過對血小板凍存技術的改進，在器官移植（尤其是干細胞移植）、危急重癥疾病、特殊血型、大劑量化療等相關治療新技術的應用中，發(fā)揮其不可替代的作用。

資料與方法

一、試劑、儀器與主要設備 二甲基亞砜原液、注射用0.9%生理鹽水、FC500流式細胞儀配套校準、測定試劑、FC500流式細胞儀、KX-21血細胞分析儀、5mL一次性使用無菌注射器、-80℃冰箱、空氣孵育振蕩器TITRAMAX1000、XHZ-IB型血小板恒溫振蕩保存箱、KJX-IA冰凍血漿解凍箱、SW-CT凈化工作臺。

二、樣本來源 從符合國家GB18467-2011《獻血者健康檢查要求》的獻血者中隨機選取16例（n=16），年齡為18～55周歲。用Trima全自動血細胞分離機及耗材進行采集。要求：紅細胞比積為0.35～0.55、血小板計數(shù)＞2.5×1011/L；在獻血前1d內未吃高脂食品、未飲含酒精類飲料；2周內沒有服用過阿司匹林及其它影響血小板功能的任何相關藥物；未檢測到出凝血性疾病。當日不空腹，上肢靜脈充盈良好，捐獻機采血小板間隔時間≥1月，近6月內未獻過全血；血小板收集量為80～100mL。血液采集時間正常，穿刺順利，采集過程中未有血流不暢等情況。

三、冰凍血小板的制備 將采集的機采血小板在血小板恒溫振蕩保存箱內振蕩2～4h，在檢查血小板已解聚、無異常后，在百級凈化臺內用一次性使用無菌注射器準確抽取所需DMSO的量，消毒血小板袋頂端的留樣管，穿刺入消毒好的留樣管內，針尖伸入袋內1～2cm。血小板袋置于振蕩器上，以1mL/min緩慢、勻速地推入。加入DMSO的過程須緩慢、均勻，并輕柔順時針晃動血小板。推藥結束、拔出針頭、排出袋內空氣、熱合封口、檢查血小板袋有無被針尖刺破，袋身有無被DMSO燒灼變白，再次檢查有無血小板聚集、蛋白析出。加藥前，盡量排盡袋內空氣，加藥時的振蕩會使殘余的空氣形成大量氣泡。將每個加好5%DMSO的血小板分裝到冷凍管中，每管5～8mL；放入-80℃低溫冰箱中冰凍保存。

四、檢測 冰凍保存6月、12月后，分別將保存在-80℃低溫冰箱中的16個標本復融后立即進行6項指標（血小板計數(shù)、平均血小板體積、血小板分布寬度、CD42b、CD61、CD62P）的檢測。

五、統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)質控后采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、-80℃時冰凍保存后6月的血小板與新鮮血小板各項指標檢測結果

將血小板冰凍保存在-80℃后6月的4個指標（血小板回收率，MPV增加值，CD42b，CD62p）與血小板冰凍前的指標進行比較：冰凍保存6月的血小板與冰凍前血小板相比，CD42b無統(tǒng)計學意義，而CD62p與冰凍前血小板相比則差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），見表1。

二、-80℃時冰凍保存后12月的血小板與新鮮血小板各項指標檢測結果

將血小板冰凍保存在-80℃后12月的4個指標（血小板回收率，MPV增加值，CD42b，CD62p）與血小板冰凍前的指標進行比較：冰凍保存12月的血小板的CD42b、CD62p與冰凍前血小板相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

討 論

血小板輸注是臨床救治出血及各種原因所致的血小板減少的重要手段。但目前血小板從新鮮血液中采集后僅能在（22±2）℃振蕩條件下保存5d時間，且使用前需要提前預約，因此無法保障臨床急診患者的需求，特別是偏遠地區(qū)。這在很大程度上制約了臨床出血患者的緊急搶救，因此新鮮血小板的保存方法一直是國內外輸血界關注的問題[12]。

表1 冰凍保存6月與冰凍前的檢測結果

表2 冰凍保存12月與冰凍前的檢測結果

在低溫條件下，生物細胞的代謝速度減慢，在-80℃以下冰箱內或-196℃液氮中，細胞代謝趨于停滯，可以長期保存。雖然程序降溫，超低溫（-196℃）液氮凍存細胞是維持細胞生物活性、功能的最理想方法，但由于設備要求高，技術難度大，設備條件需長期更換液氮，可能因偶然因素徹底損壞細胞等不利因素，不太適用于存量較大的血小板凍存。因此避開程序降溫液氮保存，-80℃深低溫冰箱凍存是維持生物細胞、組織活性、保留新鮮血小板生理功能較理想的方法之一。

冷凍保存血小板的止血功能明顯＞22℃保存的血小板，可能與冷凍保存后血小板膜表面新的亞群的產(chǎn)生有關。CD62p（血小板激活的重要標志）的再表達表明，血小板通過低溫保存后產(chǎn)生了新亞群，新亞群膜表面功能分子的變化與其體內存活率減低而即刻止血功能增強密切相關[13]。冷凍保存后血小板膜CD62p表達水平明顯升高，說明在保存過程中存在血小板的激活現(xiàn)象。其激活的機制除與內皮抑制功能消失有關外，還可能與血小板懸浮液中促凝物質的增加有關。有研究顯示[14]，血小板懸浮液中的補體成分、凝血酶和纖溶酶都能導致血小板的活化。

本次實驗表明，凍存6月之內的機采血小板其各項功能指標均符合質量要求，沒有發(fā)生顯著變化；而凍存時間半年以上的冰凍血小板其各項功能指標發(fā)生明顯下降。因此，建議冰凍血小板的凍存時間以半年為佳。5%DMSO-80℃冰凍保存半年以內的機采血小板具有良好的止血功能，其在臨床中的應用得到了肯定。

雖然冰凍血小板輸注后，患者血小板增加值及體內回收率較低，但是冰凍血小板保存時間較長，特別適合急、危重患者及節(jié)假日期間出血患者的輸注，能讓出血患者及時度過生命危險期，方便臨床[15]。由于捐獻血小板的獻血者緊急情況下不易找到，機采血小板采集時間又長，如臨床急需時無法及時得到供應，故冰凍血小板的制備無疑確保了臨床急用血小板的需求[16]。

保存期內，血小板的活性與冰凍前差異無統(tǒng)計學意義，其超微結構雖然有了一定程度的改變，產(chǎn)生了新的亞群，但即刻止血功能效果良好。盡管需要進一步完善制備、保存和融解技術，但冰凍后血小板的功能無明顯變化，長期保存后質量穩(wěn)定[17]，融化方法簡單、供應及時，將成為臨床急診患者的最佳選擇。

綜上所述，冰凍保存血小板的研究工作雖然已經(jīng)開展了20多年，但至今尚未有突破性進展[18]，其最佳制備、最佳保存溫度、最佳保存期限等等一系列問題還在探討和優(yōu)化中。深低溫凍存血小板的研究有著非常廣闊的前景，其對臨床輸血的重要性也是不言而喻的，我們期望通過本研究可以探明深低溫冰箱凍存血小板的理論基礎，對血小板凍存技術的改進，取得方法上的突破。冰凍保存血小板在當下看來有可能是新鮮血小板替代物的最佳侯選者，假如能夠替代成功，那么其意義將是深遠和巨大的。