復(fù)方降脂顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其作用機(jī)制的研究

王洪霞 王賢嫻

迄今為止世界范圍內(nèi)糖尿病患者已經(jīng)超過3.5億，其中我國糖尿病的發(fā)生率為9.7%，占全球糖尿病患者的30%[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是糖尿病中最為常見的一種類型，是由胰島素分泌量相對(duì)不足或敏感度降低引起的內(nèi)分泌代謝疾病。糖尿病患者常伴隨著高血脂癥，高血糖合并高血脂可明顯加速大、中動(dòng)脈血管粥樣硬化的進(jìn)展，嚴(yán)重危害患者的健康[2]。臨床上對(duì)糖尿病合并高血脂癥的藥物治療多采用化學(xué)合成的西藥，雖然短期內(nèi)效果顯著，但同時(shí)會(huì)有一定的毒性不良反應(yīng)[3～6]。因此，尋找一種能有效降糖和降脂且不良反應(yīng)小的藥物對(duì)于糖尿病合并高血脂癥的治療具有重要意義。

前期研究表明復(fù)方降脂顆粒能降低血脂水平，但其是否具有降糖作用尚未見研究。本研究通過建立T2DM大鼠模型，觀察復(fù)方降脂顆粒對(duì)造模大鼠血糖、胰島素的影響，分析其對(duì)胰島和胰島細(xì)胞的保護(hù)作用，最后檢測(cè)各組大鼠胰腺組織中PI3K、PDK-1、pAKT 蛋白的表達(dá)，以探討復(fù)方降脂顆粒對(duì)T2DM的降糖作用及其作用機(jī)制，為臨床治療糖尿病合并高血脂癥提供參考。

材料與方法

1.材料:(1)試劑：復(fù)方降脂顆粒由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(新藥制字Z20030013)。鏈脲佐霉素(STZ)購自美國Sigma公司。高糖高脂飼料購自北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。兔抗大鼠GAPDH、PI3K、PDK-1以及pAKT單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗體購自武漢谷歌生物科技有限公司。BCA定量試劑盒，葡萄糖氧化酶試劑盒和胰島素放射免疫試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。目的基因引物由金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量130±10g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：65000700000045。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)，動(dòng)物房12h/12h晝夜規(guī)律，分籠飼養(yǎng)，可自由攝食水，飼養(yǎng)溫度為22±2℃。

2.分組與造模：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組10只，造模組30只，分別給予普通飼料和高糖高脂飼料(豬油∶蔗糖∶奶粉∶雞蛋∶常規(guī)飼料=10∶20∶4∶3∶64)喂養(yǎng)6周后，均禁食不禁水12h，造模組腹腔注射35mg/kg STZ(用0.1mol/L的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，調(diào)節(jié)pH值至4.4，現(xiàn)配現(xiàn)用)兩周后，尾靜脈采血，血糖儀檢測(cè)空腹血糖≥7.8 mmol/L為T2DM大鼠造模成功。造模成功率為90%，有27只大鼠造模成功，隨機(jī)選取20只用來進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

3.干預(yù)方法：隨機(jī)將造模成功的20只大鼠分成兩組，分別是模型組和復(fù)方降脂顆粒組，每組10只，以未造模并以普通飼料喂養(yǎng)的10只大鼠為正常對(duì)照組。復(fù)方降脂顆粒組以灌胃的方法給予600mg/kg復(fù)方降脂顆粒[臨床上患者每次服用1袋(8g),每天3次]，正常組和模型組分別給予等量0.9%NaCl注射液，每天1次，持續(xù)給藥8周。藥物干預(yù)期間用普通飼料喂養(yǎng)大鼠。

4.復(fù)方降脂顆粒對(duì)糖尿病大鼠血清中血糖、胰島素水平的影響：干預(yù)周期完成后，所有動(dòng)物禁食不禁水12h, 尾靜脈末梢采血0.2ml, 5000r/min離心10min后取上清，-20℃凍存?zhèn)溆谩７謩e采用葡萄糖氧化酶試劑盒和胰島素放射免疫試劑盒檢測(cè)各組大鼠空腹血糖水平(FBG)以及空腹胰島素水平(FINS)。胰島素敏感指數(shù)(ISI)=In[1/(FBG/FINS)]。

5.復(fù)方降脂顆粒對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織病理學(xué)的影響：取血后大鼠處死，在無菌條件下解剖并快速取出胰腺，各組分別稱取100mg用于檢測(cè)組織中蛋白表達(dá)。剩余的組織用10%甲醛溶液固定，進(jìn)行包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色、封片處理。光學(xué)顯微鏡下采集胰腺組織胰島區(qū)域的圖片，分析組織病理學(xué)改變。

6.qRT-PCR檢測(cè)PI3K、PDK-1、pAKT的表達(dá)：用Trizol一步法提取胰腺組織中總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A260/A280的比值為1.8～2.0可認(rèn)為純度合格，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過qRT-PCR對(duì)各組胰腺組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較和分析。引物序列如表1所示，PCR的參數(shù)設(shè)置為：95℃預(yù)變性4min后，以95℃運(yùn)行20s，60℃退火并延伸30s的方法循環(huán)35周期擴(kuò)增，至少重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集熒光信號(hào)，記錄每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)用Ct值表示，以內(nèi)參β-actin為對(duì)照，用2-△CT計(jì)算相對(duì)含量。

表1 用于RT-PCR檢測(cè)的基因引物序列

7.胰腺組織中PI3K、PDK-1、pAKT蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：取各組大鼠100mg的胰腺組織，加入RIPA細(xì)胞裂解液，低溫勻漿裂解后提取組織總蛋白。BCA定量試劑盒定量各組織樣本的總蛋白濃度，用Loading buffer調(diào)節(jié)各樣本濃度使其一致。配置12%的SDS-PAGE膠，各樣本上樣50μg，以高分子marker鑒別條帶位置。Bio-Rad電泳儀恒壓70V跑120min后，取出膠塊，放置到轉(zhuǎn)膜槽中，300mA恒流跑100min從而將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA孵育PVDF膜2h來封閉非特異性位點(diǎn)，TBST洗膜，重復(fù)3次，每次15min。加入PI3K、PDK-1以及pAKT的單克隆抗體，4℃條件下孵育過夜，TBST洗膜，重復(fù)3次。加入HRP-IgG二抗，室溫下孵育2h，TBST洗膜，重復(fù)3次。將PVDF膜轉(zhuǎn)移至凝膠成像儀中，滴加顯影液后曝光并采集圖片，用Image J圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

結(jié) 果

1.復(fù)方降脂顆粒對(duì)糖尿病大鼠血清中血糖、胰島素水平的影響：檢測(cè)各組大鼠血清中FBG、FINS水平，并計(jì)算ISI值。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠的血清FBG、FINS水平顯著升高，ISI值顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，復(fù)方降脂顆粒組大鼠的血清FBG、FINS水平顯著降低(P<0.05)，同時(shí)ISI值顯著升高(P<0.05)，詳見表2。

表2 各組大鼠FBG、FINS、ISI的水平檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；胰島素敏感指數(shù)(ISI)=In[1/(FBG/FINS)]

2.復(fù)方降脂顆粒對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織病理學(xué)的影響：HE結(jié)果顯色，正常組的胰腺組織結(jié)構(gòu)完整且形態(tài)規(guī)則，胰島細(xì)胞緊密且大小均一，胞質(zhì)豐富無空泡化；模型組的胰腺組織損傷嚴(yán)重，胰島和胰腺細(xì)胞均出現(xiàn)退行性萎縮，僅有少數(shù)水腫變性的胰島細(xì)胞稀疏分布，細(xì)胞間隙出現(xiàn)大量出血點(diǎn)；與模型組比較，復(fù)方降脂顆粒組的胰腺組織損傷程度明顯減輕，胰島細(xì)胞數(shù)目增多伴隨水腫變形程度改善，細(xì)胞間隙偶有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,詳見圖1。

圖1 復(fù)方降脂顆粒對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織病理學(xué)的影響(HE，×200)A.正常組；B.模型組；C.復(fù)方降脂顆粒組

3.胰腺組織中PI3K、PDK-1、pAKT mRNA水平的檢測(cè): 模型組PI3K、PDK-1和pAKT mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組(P<0.05)。復(fù)方降脂顆粒組PI3K、PDK-1和pAKT mRNA水平顯著高于模型組(P<0.05)，詳見圖2。

4.胰腺組織中PI3K、PDK-1、pAKT蛋白表達(dá)水平的檢測(cè): 與正常組比較，模型組胰腺組織中的PI3K、PDK-1和pAKT的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。復(fù)方降脂顆粒組中PI3K、PDK-1和pAKT的蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P<0.05)，詳見圖3。

圖2 各組大鼠胰腺中PI3K、PDK-1、pAKT mRNA水平與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖3 各組大鼠胰腺中PI3K、PDK-1、pAKT蛋白的表達(dá)情況A.蛋白免疫印跡；B.蛋白相對(duì)表達(dá)結(jié)果；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

糖尿病是目前危害人類健康的第3大慢性疾病，其發(fā)生率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，目前尚無根治的方法[8，9]。糖尿病患者并發(fā)血脂異常的比例較高，糖尿病合并高血脂癥會(huì)進(jìn)一步增加大血管和微血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[10]。目前治療糖尿病合并高血脂癥的藥物雖然短期內(nèi)效果顯著，但是易耐藥且會(huì)引發(fā)多種不良反應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到限制[11]。因此，尋找高效且不良反應(yīng)小的臨床治療藥物意義重大。前期研究證實(shí)復(fù)方降脂顆粒具有利濕降濁、化瘀消積等功效，在臨床上多用于治療高脂血癥，能有效降低患者的血脂水平[12]。但目前關(guān)于其在糖尿病治療方面的研究報(bào)道尚無，本實(shí)驗(yàn)主要研究復(fù)方降脂顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠血糖、胰島素水平以及胰島細(xì)胞形態(tài)的影響，并初步探究其降糖機(jī)制。

通過檢測(cè)正常組、模型組以及復(fù)方降脂顆粒組的FBG、FINS的水平，計(jì)算ISI指數(shù)來評(píng)價(jià)復(fù)方降脂顆粒的降糖和改善胰島素抵抗的作用。與模型組比較，復(fù)方降脂顆粒組有效降低T2DM大鼠的血糖和胰島素水平。同時(shí)通過計(jì)算ISI可知，復(fù)方降脂顆粒組的T2DM大鼠的胰島素抵抗情況得到顯著改善。說明復(fù)方降脂顆粒能發(fā)揮降糖和改善胰島素抵抗作用。本研究進(jìn)一步探究了復(fù)方降脂顆粒對(duì)胰腺組織病理學(xué)的影響，HE染色發(fā)現(xiàn)，復(fù)方降脂顆粒組的胰腺組織受損程度得到明顯減輕，胰島細(xì)胞的數(shù)目增多的同時(shí)，細(xì)胞水腫變形程度也得到明顯改善，說明復(fù)方降脂顆粒能對(duì)T2DM大鼠的胰腺起保護(hù)作用。以上結(jié)果說明，復(fù)方降脂顆粒在降低T2DM大鼠的血糖和胰島素水平的同時(shí)，能有效地保護(hù)大鼠的胰島和胰島細(xì)胞，但其作用機(jī)制尚未明確，所以本研究就復(fù)方降脂顆粒的成分探討了其可能的作用機(jī)制。

改善胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是治療T2DM的一個(gè)重要途徑，其中PI3K/AKT信號(hào)通路是胰島素下游的重要信號(hào)通路，與糖尿病的發(fā)展密切相關(guān)[13]。PI3K在細(xì)胞外生長(zhǎng)因子的作用下激活，產(chǎn)生二磷酸磷脂酰肌醇和三磷酸磷脂酰肌醇，AKT在二磷酸磷脂酰肌醇的作用下產(chǎn)生同源二聚體并部分激活，進(jìn)而在三磷酸磷脂酰肌醇以及磷酸肌醇脂依賴性蛋白激酶(PDK)的作用下錨定在細(xì)胞膜上，活化的AKT實(shí)現(xiàn)磷酸化并激活下游一系列信號(hào)通路，從而影響胰島素對(duì)機(jī)體的降血糖功能，發(fā)揮保護(hù)胰島細(xì)胞和調(diào)節(jié)胰島素分泌的作用[14，15]。復(fù)方降脂顆粒由澤瀉、五谷蟲、蒲黃、三七、黃芪、淫羊藿等組成。復(fù)方降糖脂顆粒能夠有效降低T2DM大鼠中的血糖含量可能是因?yàn)槠浜袧蔀a、三七等成分。有研究報(bào)道，三七皂苷以及澤瀉提取物均能上調(diào)pAKT的表達(dá)，從而促進(jìn)下游的葡糖糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[16，17]。本研究先后采用qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)胰腺組織中PI3K、PDK-1以及pAKT的表達(dá)，來初步探究復(fù)方降脂顆粒發(fā)揮降糖作用的相關(guān)機(jī)制。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組PI3K、PDK-1和pAKT mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，復(fù)方降脂顆粒組呈顯著上升趨勢(shì)，說明復(fù)方降脂顆粒的作用機(jī)制與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)，但是否是其中的三七、澤瀉抑或是其他成分起作用還需后面的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，復(fù)方降脂顆粒能有效地降低T2DM大鼠的血糖和胰島素含量，改善胰島素抵抗情況，其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)，是臨床治療糖尿病合并高脂血癥的重要候選藥物。