紫草素抗雌激素對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的影響

楊 陽 高文雅 陶仕英 牛建昭 趙丕文 王燕霞 饒晨晨 楊 蕾

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)生率和病死率呈不斷上升的趨勢，嚴(yán)重影響女性的身心健康[1]。研究表明，乳腺癌的發(fā)生與雌激素的刺激密切相關(guān)，降低患者體內(nèi)雌激素水平可以抑制腫瘤生長[2]。臨床多采用手術(shù)切除、放療、化療等治療方法,但這些治療方法對患者的身體均存在不同程度的損害，因此，尋找有效治療腫瘤且不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物成為近年來研究的一個(gè)重要方向。紫草素(shikonin，SK)是一種萘醌類化合物，從中藥紫草的根中提取，是紫草主要的有效成分。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紫草素還具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[3]。

雌激素信號通路在調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用,ERα是雌激素信號通路中的關(guān)鍵因子[4，5]。多項(xiàng)研究表明，cyclin D1是可能受雌激素影響的重要細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之一, ERα的促有絲分裂作用能夠促進(jìn)細(xì)胞和動物組織中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1的表達(dá)[6，7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)SK干預(yù)后通過調(diào)節(jié)cyclin D1周期蛋白可影響人宮頸癌SiHa細(xì)胞的周期，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯，MCF-7是ER陽性乳腺癌細(xì)胞，雌激素具有促進(jìn)ER 陽性腫瘤增殖的作用[8，9]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M雌激素存在的體內(nèi)環(huán)境，研究SK對MCF-7細(xì)胞周期蛋白D1的影響。

材料與方法

1.藥物：左旋紫草素購自中國食品藥品檢定研究所。原藥品用無水乙醇作為溶劑配制，最終稀釋濃度至(1×10-8)～(1×10-6)mol/L。陽性對照組雌二醇(estrodiol，E2)購自美國Sigma公司，用無水乙醇配制，最終稀釋濃度為1×10-8mol/L[10]。

2.材料：高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；RPMI 1640 Medium(ATCC Modification，美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清(CDT-FBS，美國Hyclone公司)；0.05%胰蛋白酶(美國Invitrogen公司)；MTT(美國Sigma 公司)；DMSO(美國Sigma 公司)；Cyclin D1抗體(美國Proteintech公司)。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基溶液中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2的培養(yǎng)箱，保持37℃恒溫及相對飽和濕度。每隔3～4天進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)開始前4天用PBS洗滌，洗滌后改用無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞對雌激素樣物質(zhì)的敏感度增加，同時(shí)可以減少來自細(xì)胞自身的雌激素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)，進(jìn)行消化傳代，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、紫草素處理組(SK組，1×10-6mol/L、1×10-7mol/L和1×10-8mol/L)、雌二醇處理組(E2組，1×10-8mol/L)。

4.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測cyclin D1蛋白表達(dá)：MCF-7細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，以5×104個(gè)/毫升的細(xì)胞密度接種至24孔板。待細(xì)胞貼壁后，換含有1×10-8mol/L雌二醇和1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L SK的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后終止。吸去各孔培養(yǎng)基，每孔加入1ml PBS清洗3min×2次后，加入100μl的4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗3min×3次；加入0.01%的Triton 于37℃恒溫箱搖勻，孵育20min，PBS清洗3min×3次；加入0.3%的過氧化氫甲醇溶液，孵育10min，PBS清洗3min×3次；使用免疫組化試劑盒血清工作液進(jìn)行封閉，20min后甩去；滴加一抗，冰箱4℃孵育，過夜后取出，用PBS沖洗5min；滴加二抗，37℃恒溫箱孵育15min，PBS沖洗5min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育15min，PBS沖洗5min×3次；DAB染色，避光放置10min，鏡下觀察，自來水沖洗后用蘇木素復(fù)染10s，迅速沖洗。置于倒置顯微鏡下拍片，拍照前每孔加入1ml的PBS避免細(xì)胞干燥， 400倍放大倍數(shù)每孔隨機(jī)選擇6個(gè)視野，使用免疫組化軟件Image pro plus進(jìn)行灰度測量分析。

5．Western blot法檢測cyclin D1蛋白的表達(dá)：MCF-7細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以5×104個(gè)/毫升的細(xì)胞密度接種至24孔板。細(xì)胞貼壁后，換含有1×10-8mol/L雌二醇和1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L SK的DMEM培養(yǎng)液。藥物作用48h后，在收集的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，12000×g離心5min，對上清液蛋白含量進(jìn)行測定、分析。蛋白變性之后開始上樣，SDS-PAGE 電泳(濃縮膠80V，分離膠120V)，80V電壓轉(zhuǎn)膜75min。將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉溶液中在37℃恒溫箱振搖1h封閉，分別加cyclin D1、GAPDH一抗，4℃冰箱孵育過夜。加二抗(HRP 標(biāo)記)在37℃恒溫箱振搖1h后，將PVDF膜放入ECL混合液，在室溫條件下水平搖床孵育5min，最后進(jìn)行X線片曝光，顯影、定影、掃描后，以GAPDH表達(dá)量為對照，Image pro plus軟件觀察分析結(jié)果，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)各組灰度值。

結(jié) 果

1.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測cyclin D1蛋白表達(dá)：紫草素作用MCF-7細(xì)胞48h后， cyclin D1蛋白棕黃色顆粒在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中有陽性表達(dá)。其中雌二醇組表達(dá)量與空白對照組比較顯著增多；與空白對照組比較，SK各組表達(dá)較少，呈淡棕色，且cyclin D1蛋白表達(dá)量隨著SK濃度的升高逐漸被抑制(P<0.05)，詳見圖1。

2.Western blot法檢測紫草素1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L不同濃度組對cyclin D1蛋白表達(dá)的作用：與空白對照組比較，紫草素作用MCF-7細(xì)胞48h后，3個(gè)藥物濃度組1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L顯著降低了cyclin D1的表達(dá)，并且隨著濃度的升高表達(dá)量逐漸降低，其中1×10-6mol/L紫草素對cyclin D1表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)(P<0.01),詳見圖2。

圖2 紫草素作用后MCF-7細(xì)胞中cyclin D1蛋白的表達(dá)水平與空白對照組比較， *P<0.05， **P<0.01

3.Western blot法檢測紫草素在雌二醇環(huán)境下對cyclin D1蛋白表達(dá)的影響：與空白對照組比較，雌二醇干預(yù)后，cyclin D1的蛋白表達(dá)量有所提高；經(jīng)紫草素1×10-6mol/L單獨(dú)作用后，cyclin D1的蛋白表達(dá)含量有顯著降低(P<0.01)；雌二醇干預(yù)后，SK對cyclin D1蛋白量的表達(dá)同樣具有抑制作用(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 紫草素對雌激素處理的MCF-7 cyclinD1蛋白表達(dá)的影響與空白對照組比較，*P<0.05, **P<0.01; E2+紫草素組;用1×10-8mol/L雌二醇處理后的SK組(1×10-6mol/L)組

討 論

乳腺癌是一種雌激素依賴性的惡性腫瘤,雌激素效應(yīng)主要受ERα介導(dǎo)基因組途徑和非基因自途徑的調(diào)節(jié)，ERα在乳腺癌增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，是一種經(jīng)典的核受體途徑[2]。研究發(fā)現(xiàn)，紫草素這種天然萘醌類化合物對ERα陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞具有抑制作用，但具體如何通過ERα信號通路發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步研究和探討[11，12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，作用MCF-7細(xì)胞48h后， SK各濃度組與空白對照組比較，顯著抑制了cyclin D1的表達(dá)，并且體現(xiàn)出濃度依賴性，即cyclin D1的表達(dá)量隨著SK濃度的升高逐漸降低，其中1×10-6mol/L紫草素對cyclin D1表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)(P<0.01)。同時(shí)，為了進(jìn)一步完善此實(shí)驗(yàn)，探究在人體內(nèi)雌激素作用條件下SK是否對乳腺癌還具有相同的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)利用雌二醇模擬體內(nèi)雌激素環(huán)境，探究雌二醇干預(yù)后，SK是否仍對MCF-7細(xì)胞中的cyclin D1蛋白具有抑制作用。該部分結(jié)果顯示，與空白對照組比較，雌二醇單獨(dú)作用條件下cyclin D1蛋白表達(dá)量有所提高； 1×10-6mol/L SK單獨(dú)作用后，cyclin D1蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；雌二醇干預(yù)下，SK作用48h后，cyclin D1蛋白的表達(dá)量也有顯著降低(P<0.05)，這說明SK對MCF-7細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)量的作用可能不受雌激素的影響，即在人體中SK可能會對乳腺癌具有非雌激素依賴性的抑制作用。

cyclin D1能夠精確調(diào)控細(xì)胞周期，從而維持細(xì)胞正常生長發(fā)育平衡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失衡，細(xì)胞增殖失調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤形成[14]。cyclin D1是重要的正性調(diào)節(jié)因子，作用于G1期，參與細(xì)胞周期G1/S期調(diào)控，具體機(jī)制為cyclin D1在G1期與CDK4/CDK6結(jié)合，并使其活化，活化的CDK4/CDK6能使Rb磷酸化，磷酸化的pRb活化雌二醇F促進(jìn)了DNA的合成，促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，最終cyclin D1的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖，當(dāng)與其他基因或基因產(chǎn)物異常配合時(shí)，共同參與癌變的發(fā)生[15～17]。cyclin D1蛋白和乳腺的關(guān)系比較密切，研究顯示將小鼠的胚胎干細(xì)胞CCND1基因敲除后發(fā)現(xiàn)雖然缺乏cyclin D1蛋白表達(dá)的小鼠仍具有生存和生育能力，但是存在妊娠期乳腺腺泡發(fā)育障礙和泌乳功能的缺失。周春等[18]采用免疫組織化學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌中cyclin D1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于良性乳腺組織。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，紫草素對人宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖具有抑制作用, 其誘導(dǎo)G0/G1期阻滯的機(jī)制可能和cyclin D1蛋白有關(guān)[8]。黃彩梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖隨著紫草素濃度的增加及作用時(shí)間的延長逐漸被抑制，紫草素可能是通過對雌激素信號通路中ERα、cyclin D1、c-myc蛋白表達(dá)的抑制，起到抑制Ishikawa細(xì)胞增殖的作用。這些結(jié)果都提示cyclin D1對乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展存在關(guān)鍵的調(diào)控作用，而紫草素有可能對cyclin D1蛋白具有抑制作用。

本研究從ERα信號通路角度出發(fā)，在前期發(fā)現(xiàn)的SK可影響ERα陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討調(diào)控周期的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SK對cyclin D1的表達(dá)有抑制作用，并且這種抑制作用不受雌激素的影響，這為天然化合物從細(xì)胞周期角度調(diào)控ERα通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)cyclin D1的表達(dá)，最終破壞ERα陽性乳腺癌細(xì)胞的周期調(diào)控機(jī)制提供了一個(gè)可能性，但具體機(jī)制需要深入研究和探討。