腺苷脫氨酶在兒童EB病毒相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征中的意義

高 慧 張俊峰 劉娟娟 沈紅強(qiáng)

噬血細(xì)胞綜合征又稱噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥(hemophagocyticlymphohistiocytosis，HLH)，是免疫系統(tǒng)過度活化的炎性反應(yīng)綜合征，是兒科危重難治性疾病，臨床上以持續(xù)高熱和巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生噬血現(xiàn)象為主要特征[1]。HLH分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型，原發(fā)性HLH由遺傳性免疫缺陷導(dǎo)致，而繼發(fā)性HLH常由感染、腫瘤、自身免疫性疾病誘發(fā)。無論原發(fā)性還是繼發(fā)性，感染都是最常見的觸發(fā)因素，而EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染最多見。EBV相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征可在慢性活動(dòng)性EB病毒感染基礎(chǔ)上發(fā)生HLH，因此尋找對(duì)EBV-HLH早期診斷與鑒別診斷及預(yù)后評(píng)估有價(jià)值的臨床指標(biāo)具有重要意義。

腺苷脫氨酶(ADA)是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要相關(guān)性的核酸代謝酶，ADA在淋巴細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞分化成熟中具有重要作用[2]。大量研究表明，血清或體液ADA水平在結(jié)核性腦膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者及2型糖尿病等的鑒別診斷和免疫功能研究中具有重要的臨床意義[3～5]。

本研究通過檢測(cè)EBV-HLH患兒血清ADA水平，分析其在鑒別診斷EBV-HLH與慢性活動(dòng)性EBV感染、評(píng)估臨床療效和預(yù)后判斷中的價(jià)值。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2015年1月～2017年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院初次入院確診為EBV-HLH的72例患兒為研究對(duì)象，同期80例慢性活動(dòng)性EBV感染患兒為對(duì)照組，健康體檢兒童為健康對(duì)照組，年齡1～18歲。EBV-HLH診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：有明確EBV感染證據(jù)并符合HLH-2004指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)。定義外周血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)>500拷貝數(shù)/毫升即診斷為EBV感染; HLH的診斷參照國(guó)際組織細(xì)胞學(xué)會(huì)制定的HLH-2004方案，滿足符合以下8項(xiàng)中的5項(xiàng)：①發(fā)熱；②脾腫大；③外周血兩系或三系減少血紅蛋白<90g/L、 血小板計(jì)數(shù)<100×109/L、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值<1.0×109/L；④高甘油三酯血癥或低纖維蛋白原血癥(甘油三酯≥3.0mmol/L, 纖維蛋白原<1.5g/L)；⑤血清鐵蛋白升高(≥500μg/L);⑥可溶性CD25升高(≥2400U/ml)；⑦NK細(xì)胞活性減低或缺失；⑧骨髓、脾臟、腦脊液或淋巴結(jié)活檢發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞增生并伴噬血細(xì)胞現(xiàn)象, 且無惡性疾病證據(jù)。CAEBV感染診斷參照2005年Okano 等[7]修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.研究方法：所有研究對(duì)象為當(dāng)日空腹靜脈血3ml，3000r/min，離心10min，取血清后于當(dāng)天檢測(cè)。貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑，采用酶法測(cè)定ADA、ALT及AST。檢測(cè)前當(dāng)日室內(nèi)質(zhì)量控制均在控。根據(jù)ALT、AST水平將EBV-HLH患者分為肝功能正常組和肝功能異常者，比較兩組間ADA水平。并比較分析肝功能正常的EBV-HLH患者和健康對(duì)照組ADA水平差異。根據(jù)患者臨床治療轉(zhuǎn)歸，將72例EBV-HLH患者分為生存組與死亡組，對(duì)比分析兩組間實(shí)驗(yàn)室特征。采用熒光定量PCR分析儀檢測(cè)血漿EBV DNA拷貝數(shù)，并對(duì)ADA水平與EBV DNA拷貝數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

結(jié) 果

1.臨床資料：EBV-HLH組和CAEBV組患兒一般臨床資料詳見表1。72例EBV-HLH患兒年齡為1歲1個(gè)月～14歲3個(gè)月，中位年齡為2.8歲，其中男性38例，女性34例; CAEBV組患兒80例，其中男性38例，女性42例,患兒年齡6個(gè)月～12歲7個(gè)月，中位年齡2.7歲。同期健康體檢者為對(duì)照組50例，其中，男性26例，女性24例，中位年齡3.2歲。

表1 EBV-HLH組和CAEBV組患兒一般情況和臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分析

2.EBV-HLH組、CAEBV組及健康對(duì)照組患兒ADA水平比較: EBV-HLH組ADA水平為102.4±64.9U/L, CAEBV組ADA水平為42.8±22.1U/L，而健康對(duì)照組的 ADA 水平為13.3±3.2U/L，通過非參數(shù)檢驗(yàn)得出3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000), EBV-HLH組ADA水平明顯高于CAEBV組(Z=4.709，P=0.000)，CAEBV組顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.008，P=0.000),詳見圖1。

圖1 EBV-HLH組、CAEBV組和健康對(duì)照組ADA水平比較

3.ROC分析: 根據(jù)EBV-HLH組及CAEBV組血清ADA水平繪制ROC曲線，以CAEBV組為對(duì)照，分析得出ADA診斷EBV-HLH的ROC曲線下面積為0.801，95%CI:0.827～0.940，取其閾值為57.5U/L時(shí)，敏感度為74.7%，特異性為89.1%，詳見圖2。

4.肝臟功能對(duì)ADA水平的影響: 根據(jù)ALT、AST水平(表2)，將EBV-HLH組分為肝功能正常組和肝功能異常組，前者24例，后者48例。肝功能正常的EBV-HLH患兒ADA水平為63.57±39.95U/L，肝功能異常的EBV-HLH患兒中ADA 水平為120.65±66.64U/L，其中肝功能正常的EBV-HLH患者 ADA 水平與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.121，P=0.000)。并且肝功能正常的EBV-HLH患者 ADA 水平與肝功能異常的患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.583，P=0.000)。

圖2 EBV-HLH患者ADA分布的ROC曲線

表2 EBV-HLH患者肝功能狀況分析

5.EB病毒DNA拷貝數(shù)與ADA的相關(guān)性分析: 72例EBV-HLH患兒EB病毒拷貝數(shù)為4.39±1.18logU/ml,Pearson相關(guān)分析得出，EBV拷貝數(shù)與ADA相關(guān)系數(shù)r=0.608，呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，詳見圖3。

6.生存組和死亡組實(shí)驗(yàn)室特征比較：死亡組血清ADA水平顯著高于存活組(P=0.002)，血小板計(jì)數(shù)水平明顯降低(P=0.048)，詳見表3。

圖3 ADA水平與EBV-DNA載量的相關(guān)性

表3 生存組和死亡組EBV-HLH患兒實(shí)驗(yàn)室特征比較

討 論

ADA是機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)中一種重要核酸代謝酶,主要存在于粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中。隨著淋巴細(xì)胞分化程度的增高,其酶活力逐漸降低。近年來血清及體液中ADA活性測(cè)定已在多種疾病的診斷、鑒別診斷以及免疫障礙機(jī)制研究中越來越受到重視[8]。ADA在T淋巴細(xì)胞中的活性要高于B淋巴細(xì)胞，且可作為非特異性分子，在T淋巴細(xì)胞增殖、分化和成熟過程中發(fā)揮重要作用[9]。

EBV相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征可在慢性活動(dòng)性EB病毒感染基礎(chǔ)上發(fā)生暴發(fā)性HLH，也可在傳染性單核細(xì)胞增多癥過程中反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致患者死亡。因此尋找對(duì)EBV-HLH早期診斷與鑒別診斷及預(yù)后評(píng)估有價(jià)值的臨床指標(biāo)具有重要的意義。本研究旨在探討血清ADA水平在EBV相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征中的意義。本研究結(jié)果顯示，EBV-HLH患者ADA水平明顯高于EBV感染組，EBV感染組患兒顯著高于健康體檢者。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)血清ADA水平在淋巴瘤相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征中顯著升高。以上結(jié)果提示，ADA 的檢測(cè)可為臨床鑒別診斷EBV-HLH提供有效的參考。本研究進(jìn)一步分析ADA水平與EB病毒拷貝數(shù)的相關(guān)性，得出相關(guān)系數(shù)為0.608，呈正相關(guān)。研究表明，血漿EB病毒拷貝數(shù)可以作為生物學(xué)標(biāo)志物評(píng)價(jià)EBV感染相關(guān)性疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后[11]。進(jìn)一步比較EBV-HLH患者生存組與死亡組實(shí)驗(yàn)室特征，死亡組ADA水平顯著高于生存組，同時(shí)結(jié)果表明，血清ADA活性有助于判斷EBV-HLH患者預(yù)后情況。

根據(jù)EBV-HLH患者和EBV感染患者血清ADA水平繪制ROC曲線。結(jié)果顯示 ADA的曲線下面積為0.893，95%CI:0.827～0.940。當(dāng)閾值為57.5U/L時(shí)，敏感度為74.7%，特異性為89.1%。說明診斷準(zhǔn)確性較高，具有較高的診斷價(jià)值。文獻(xiàn)證實(shí)，ROC曲線下面積>0.9表明篩查價(jià)值很高,>0.7表明篩查價(jià)值中等[12]。結(jié)果提示，血清ADA水平在診斷EBV-HLH特別是預(yù)警CAEBV進(jìn)展為 HLH 時(shí)，具有重要參考價(jià)值。

研究證實(shí)，無論何種原因造成肝細(xì)胞受損、壞死或膜通透性增加，均能導(dǎo)致血清ADA活性增高[13]。在本研究中，肝功能異常的EBV-HLH患者ADA水平高于肝功能異常的患者，且肝功能正常的EBV-HLH患者與健康體檢者血清ADA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在噬血細(xì)胞綜合征中，ADA的分泌增加不僅來源于肝細(xì)胞的破壞，而且來源于淋巴細(xì)胞的釋放增加?？赡艿臋C(jī)制是在EBV-HLH中， EB病毒主要感染CD8+T細(xì)胞亞群，而在慢性活動(dòng)性EBV感染中，EB病毒主要侵犯CD4+T細(xì)胞亞群或NK細(xì)胞[14]。EBV作用于不同的宿主細(xì)胞，可能是兩種EBV相關(guān)性疾病發(fā)病機(jī)制和臨床特征不同的重要基礎(chǔ)。Moreno等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化過程中，ADA結(jié)合CD26分子產(chǎn)生共刺激信號(hào)，使Th1細(xì)胞顯著增加，釋放大量的促炎因子IFN-γ、TNF-α及IL-6。同時(shí)ADA受IL-2、IL-12的正向調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，EBV-HLH患兒ADA水平顯著升高，提示T淋巴細(xì)胞免疫在EBV-HLH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，為噬血細(xì)胞綜合征中細(xì)胞因子風(fēng)暴及Th1過度激活提供更有力的理論依據(jù)[16]。

綜上所述，本研究肯定ADA 在EBV-HLH患者輔助診斷中的價(jià)值，且在鑒別CAEBV是否進(jìn)展為 EBV-HLH時(shí)，具有重要意義。ADA活性有助于判斷EBV-HLH患者預(yù)后情況。因而，ADA 檢測(cè)可以成為EBV-HLH患者的一項(xiàng)常規(guī)輔助檢查，可以更好地診斷疾病并反映患者病情的發(fā)展。本研究仍然存在很多不足，如病例數(shù)偏小，為單中心觀察性臨床研究，且ADA對(duì)EBV-HLH的診斷價(jià)值未與其他指標(biāo)如鐵蛋白、sCD25等做對(duì)比性研究，期待今后開展多中心、大樣本的研究來進(jìn)一步證實(shí)。