急性肝衰竭小鼠血清與組織中PTX3、HBP、PCT及IL-6、IL-1β、TNF-α的變化及診斷價值

石春霞 陳 倩 王 瑤 焦方舟 龔作炯

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)，也稱暴發(fā)性肝衰竭，是由多種原因引起的嚴(yán)重肝臟損害，病情進(jìn)展迅速，病死率高，預(yù)后差，并且缺乏有效的治療方法，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。影響ALF生存率的因素包括病因、年齡、腦病的嚴(yán)重程度、肝壞死的程度以及患者是否有其他疾病等[1]。肝臟活檢顯示有大量肝細(xì)胞壞死和不同程度的肝臟炎癥[2]。全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)及其伴隨的多器官功能衰竭通常是患者死亡的主要原因[3]。因此，炎性反應(yīng)是ALF進(jìn)展過程中的一個重要因素。PTX3、HBP及PCT是近些年發(fā)現(xiàn)的炎性指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)用D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，檢測小鼠血清與肝臟、脾臟、小腸組織中PTX3、HBP、PCT及IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，探討PTX3、HBP、PCT及IL-6、IL-1β、TNF-α水平變化的意義以及各項指標(biāo)的診斷價值。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：(1)動物：選取32只8周齡，雄性，無特定病原體級C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。(2)藥物與試劑:D-氨基半乳糖鹽酸鹽(D-galactosamine, D-Gal)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自美國Sigma-Aldrich公司。PTX3試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司、HBP試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司、PCT試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司、IL-6試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司、IL-1β試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司、TNF-α試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

2.方法：(1)動物模型的制備與取材：將32只小鼠隨機(jī)分為兩組:①模型組16只，小鼠在禁食后12h腹腔注射D-Gal(400mg/kg)和LPS(100μg/kg)制備ALF模型；②正常組16只，于小鼠腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉注射液。12h后處死小鼠。采血，分離血清，-80℃凍存?zhèn)錂z。同時留取肝臟、脾臟、小腸組織。組織勻漿的比例按照10%進(jìn)行(即1g組織加9ml的勻漿液)，勻漿液選取磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)，濃度為0.01mol/L，pH值為7.2～7.4。將稱取重量的樣本剪碎，放入碾缽中，加入勻漿液，勻漿器勻漿，5000r/min離心15min取上清液，-80℃凍存?zhèn)錂z。(2)肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察：取小鼠肝組織約0.3cm×0.4cm于質(zhì)量濃度為40g/L的多聚甲醛溶液中固定，行常規(guī)石蠟包埋，切片后行HE染色，光鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)。其余肝組織凍存?zhèn)錂z。(3)血清肝功能的檢測：采用生化法檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和總膽紅素(TBIL)水平。(4)血清及組織 PTX3、HBP、PCT、IL-6、IL-1β、TNF-α水平的檢測：采用ELISA法檢測小鼠血清及肝臟、脾臟、小腸組織PTX3、HBP、PCT、IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié) 果

1.兩組小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化：HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，無變性和壞死，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，肝細(xì)胞大片壞死，可見大量炎性細(xì)胞浸潤,詳見圖1。

圖1 小鼠肝組織HE染色(×200)A.正常組；B.模型組

2.兩組小鼠血清肝功能水平變化：正常組小鼠血清ALT、AST、TBIL水平很低,分別為29.7±8.7U/L、27.7±9.5U/L、3.4±0.7U/L，而模型組小鼠血清ALT、AST、TBIL水平顯著升高,分別為2986.2±319.4U/L、2668.8±227.9U/L、91.3±12.2U/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),詳見表1。

表1 兩組小鼠血清肝功能指標(biāo)比較(U/L)

與正常組比較，*P<0.05

3.兩組小鼠血清及組織PTX3、HBP、PCT及IL-6、IL-1β、TNF-α水平變化：正常組小鼠血清及肝臟、小腸組織中也可檢測到PTX3，但模型組小鼠血清及肝臟、小腸組織中PTX3顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常組小鼠與模型組小鼠脾臟組織中PTX3水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清及肝臟、脾臟、小腸組織中HBP、PCT及IL-6、IL-1β、TNF-α均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),詳見圖2。

圖2 兩組小鼠血清及組織各指標(biāo)表達(dá)水平A.兩組小鼠血清及組織PTX3表達(dá)水平；B.兩組小鼠血清及組織HBP表達(dá)水平；C.兩組小鼠血清及組織PCT表達(dá)水平；D.兩組小鼠血清及組織IL-6表達(dá)水平；E.兩組小鼠血清及組織IL-1β表達(dá)水平；F.兩組小鼠血清及組織TNF-α表達(dá)水平。與正常組比較，*P<0.05

4.ROC曲線分析：各指標(biāo)的ROC曲線詳見圖3。PCT的診斷效能最高，其AUC為0.941，cut-off值為35.2pg/ml，敏感度為93.8%，特異性為87.5%，陽性預(yù)測值為88.2%，陰性預(yù)測值為93.3%；PTX3其次，AUC為0.859，cut-off值為475.4pg/ml，敏感度為81.3%，特異性為87.5%，陽性預(yù)測值為86.7%，陰性預(yù)測值為82.4%；TNF-α的診斷效能最低，其AUC為0.695，cut-off值為54.5pg/ml，敏感度為68.8%，特異性為62.5%，陽性預(yù)測值為64.7%，陰性預(yù)測值為66.7%；HBP的AUC為0.844，cut-off值為17.3pg/ml，敏感度為75.0%，特異性為81.2%，陽性預(yù)測值為80.0%，陰性預(yù)測值為76.5%；IL-6的AUC為0.832，cut-off值為50.1pg/ml，敏感度為81.3%，特異性為68.7%，陽性預(yù)測值為72.2%，陰性預(yù)測值為78.6%；IL-1β的AUC為0.762，cut-off值為15.7pg/ml，敏感度為75.0%，特異性為62.5%，陽性預(yù)測值為66.7%，陰性預(yù)測值為71.4%，詳見表2。

圖3 各指標(biāo)的ROC曲線A.PTX3；B.HBP；C.PCT；D.IL-6；E.IL-1β；F.TNF-α

討 論

ALF患者病情進(jìn)展迅速，病死率高，預(yù)后差，因此對ALF進(jìn)行早期和可靠的診斷非常重要。目前認(rèn)為ALF肝損傷的主要機(jī)制是病原體等導(dǎo)致的直接損傷和內(nèi)毒素、細(xì)胞因子等所介導(dǎo)的繼發(fā)性損傷。其中，免疫反應(yīng)的激活和炎性因子的過量產(chǎn)生在ALF中發(fā)揮著重要作用[4]。因此，炎性反應(yīng)是ALF發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

表2 各項指標(biāo)的診斷效能

PTX3、HBP及PCT參與多種疾病的炎性反應(yīng)過程，是近些年發(fā)現(xiàn)的炎性指標(biāo)。PTX3和超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitive C reaction protein, hs-CRP)、血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)同屬于正五聚蛋白超家族，hs-CRP和SAA是典型的短正五聚蛋白，而PTX3則是長正五聚蛋白的主要成員，與短正五聚蛋白在染色體定位、基因表達(dá)、細(xì)胞來源和配體等方面存在差異[5]。正常情況下PTX3儲存在中性粒細(xì)胞特定的顆粒中，在細(xì)菌感染等炎癥刺激下被激活釋放到細(xì)胞外，釋放的PTX3定位于中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)，在感染中發(fā)揮非冗余作用[6]。在許多炎癥中，PTX3是較早出現(xiàn)的生物學(xué)標(biāo)志物，相比CRP，與預(yù)后的關(guān)系更密切[7]。

受傷的肝臟庫普弗細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞也能夠產(chǎn)生PTX3，本實(shí)驗(yàn)中ALF模型小鼠血清及肝臟、小腸組織中PTX3的表達(dá)水平高于正常小鼠(P<0.05)，這表明PTX3可以反映機(jī)體的炎癥和損傷，并且ROC曲線顯示其曲線下面積為0.859，敏感度為81.3%，特異性為 87.5%，診斷價值高于IL-6、IL-1β、TNF-α(曲線下面積分別為0.832、0.762、0.695)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩組小鼠脾臟組織中PTX3水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其原因可能是脾臟組織中炎癥輕微，PTX3升高不明顯以及小鼠個體化差異所致。另外有報道顯示PTX3對感染引起的器官損傷具有保護(hù)作用。在由鼠肝炎病毒1(MHV-1)感染引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合征小鼠模型中，PTX3缺乏增加了肺中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的早期浸潤，PTX3缺失小鼠表現(xiàn)出比野生型小鼠更嚴(yán)重的肺損傷[8]。PTX3在無菌性炎癥中也有保護(hù)作用的報道，如急性肺損傷、腦缺血等[9，10]。因此，PTX3被認(rèn)為是調(diào)控早期中性粒細(xì)胞的負(fù)反饋機(jī)制，可能作為初始炎性反應(yīng)的內(nèi)在微調(diào)因子，限制過度炎癥誘導(dǎo)的組織損傷，這表明PTX3升高可能是對ALF小鼠肝功能的一種保護(hù)機(jī)制[5]。

HBP是存在于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒和分泌囊泡中的一種蛋白分子，由于其具有極強(qiáng)結(jié)合肝素的能力，因而被命名為肝素結(jié)合蛋白[11]。二者結(jié)合后HBP的活性受到明顯抑制。當(dāng)機(jī)體受到感染后，細(xì)菌蛋白或IL-8等趨化因子激活中性粒細(xì)胞，釋放大量HBP，HBP可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致血管滲漏，還具有殺菌、趨化以及調(diào)節(jié)炎癥的作用[12]。HBP還可以結(jié)合LPS，但與LPS結(jié)合后產(chǎn)生何種作用尚不清楚[13]。在膿毒癥導(dǎo)致的急性腎損傷的24h內(nèi)，HBP的表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步加重腎臟損害，在腎損傷的早期炎性反應(yīng)中起著重要作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALF模型小鼠血清及肝臟、脾臟、小腸組織中HBP的表達(dá)水平均高于正常組小鼠(P<0.05)，這與其他研究結(jié)果一致，ROC曲線顯示其曲線下面積為0.844，cut-off值為17.3pg/ml，敏感度為75.0%，特異性為81.2%，診斷效能高于IL-6、IL-1β、TNF-α。由于HBP在炎癥發(fā)生之前就已經(jīng)儲存在中性粒細(xì)胞中，受到刺激后被迅速釋放，并且可以影響多種細(xì)胞類型。因此HBP可以作為早期炎癥的標(biāo)志物，及早發(fā)現(xiàn)炎癥的發(fā)生，并給予干預(yù)，這對于急性肝衰竭的早期診斷以及延緩ALF的快速進(jìn)展具有重要意義[12]。

PCT是降鈣素的前體，含有116個氨基酸，由甲狀腺的濾泡旁細(xì)胞分泌[15]。正常情況下，PCT都轉(zhuǎn)化為降鈣素，因此健康個體的PCT濃度很低。LPS是PCT的強(qiáng)烈刺激因素，當(dāng)機(jī)體收到細(xì)菌等微生物入侵時，所有實(shí)質(zhì)細(xì)胞均被激活產(chǎn)生PCT，PCT水平會顯著升高，并且其濃度與感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在炎癥過程中，PCT生成主要受到兩種機(jī)制刺激：一是細(xì)菌內(nèi)毒素或LPS的直接刺激，二是受到炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1、IL-6的間接刺激[16]。機(jī)體感染后，PCT在2～6h內(nèi)顯著升高，6～24h達(dá)到峰值[17]。PCT水平在感染癥狀出現(xiàn)之前就已經(jīng)升高，還被應(yīng)用于指導(dǎo)膿毒癥及膿毒性休克患者的抗生素治療[18]。有研究表明，PCT對嚴(yán)重腹腔炎癥患者的預(yù)后評估具有特異性強(qiáng)、敏感度高的優(yōu)點(diǎn)，比CRP、IL-6等傳統(tǒng)炎性指標(biāo)具有更高的敏感度與特異性，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALF模型小鼠血清及肝臟、脾臟、小腸組織中PCT的表達(dá)水平均高于正常組小鼠(P<0.05)，ROC曲線顯示其曲線下面積為0.941，敏感度為93.8%，特異性為87.5%，診斷效能高于IL-6、IL-1β、TNF-α。目前，PCT已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用，在多種疾病中包括急性肝衰竭，都具有良好的輔助診斷功能。

本研究結(jié)果表明，PTX3、HBP、PCT可以用于急性肝衰竭早期的輔助診斷，其cut-off值分別為475.4、17.3、35.2pg/ml，并且較IL-6、IL-1β、TNF-α的診斷效能高。在正常組小鼠血清及組織中檢測到PTX3、HBP、PCT水平較低，而模型組小鼠血清及組織中PTX3、HBP、PCT水平明顯升高，提示PTX3、HBP、PCT可能在急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，PTX3、HBP、PCT可能是參與急性肝衰竭時器官組織功能障礙的重要介質(zhì)。